Analyse de l'internalisation du virus de la grippe à l'aide d'un essai de blocage à la streptavidine

Résumé

Source : Pohl, M. O. & Stertz, S. Mesure de l'attachement et de l'internalisation du virus de la grippe A dans des cellules A549 par cytométrie en flux. J. Vis. Exp. (2015)

Ce vidéo montre l'utilisation d'un test de blocage par la streptavidine afin de distinguer le virus de la grippe fixé à la surface de celui qui est internalisé dans les cellules épithéliales pulmonaires humaines. La comparaison des signaux de fluorescence indique qu'une intensité plus élevée après incubation témoigne d'une internalisation virale réussie.

Protocole

1. Dosage d'attachement/ internalisation

REMARQUE : Veillez à préparer tous les réactifs avant de commencer le test. Pour les trois groupes témoins présentés dans la section des résultats (cellules non infectées, cellules prétraitées avec la neuraminidase et cellules traitées avec l'azoture de sodium), de légères modifications du protocole sont nécessaires.

1. Préparez 16 tubes profonds contenant chacun 200 000 cellules A549. À côté du jeu expérimental composé de 4 tubes, il existe 3 conditions de contrôle, chacune nécessitant 4 tubes : cellules mock-infectées, cellules prétraitées à la neuraminidase (NA) et cellules traitées au NaN₃ (azoture de sodium). Chaque groupe comprend 4 tubes étiquetés « 0 min », « 0 min + streptavidine (STV) », « 30 min », « 30 min + STV ».
2. Centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 200 µl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Centrifugez les tubes à 4 °C à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 200 µl de milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 0,3 % d'albumine sérique bovine (BSA), 20 mM de 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) et 1 % de pénicilline-streptomycine (milieu d'incubation). Incubez pendant 30 min à 37 °C.
   REMARQUE : Pour le contrôle à la neuraminidase : utilisez une neuraminidase bactérienne (par exemple, sialidase issue de Vibrio cholerae) à une concentration de 200 mU/ml diluée dans le milieu d'incubation pour remettre les cellules en suspension.
4. Centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 200 µl de PBS. Répétez cette étape une fois supplémentaire, puis refroidissez les tubes sur de la glace pendant 10 min.
5. Centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 100 µl de virus biotinylé (utilisez la concentration de virus déterminée à la section 2, diluée dans du PBS d'infection). Incubez 1 h sur de la glace.
6. Centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 200 µl de PBS. Répétez cette étape une fois supplémentaire.
   REMARQUE : Pour le contrôle mock-infecté : utilisez du PBS d'infection sans virus. Pour le contrôle à l'azoture de sodium : utilisez le virus dilué dans du PBS d'infection supplémenté de 0,1 % d'azoture de sodium.
7. Traitement des échantillons après l'infection sur glace :
   1. Pour les échantillons « 0 min », suivez l'étape 2.5 et conservez les échantillons à 4 °C jusqu'à ce que les autres échantillons soient fixés.
   2. Pour les échantillons « 0 min + STV », centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension les culots dans 50 µl de STV (utilisez la concentration déterminée à la section 3) diluée dans du PBS contenant 2 % de BSA et 0,1 % d'azoture de sodium (afin d'empêcher l'internalisation pendant la manipulation de l'échantillon). Incubez 30 min sur de la glace.
   3. Centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 200 µl de PBS. Répétez cette étape une fois supplémentaire.
   4. Pour la fixation, centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 100 µl de paraformaldéhyde (PFA) à 3,7 %. Incubez pendant 10 min à température ambiante (TA). Ensuite, répétez l'étape de lavage décrite à l'étape 1.6) et conservez les échantillons à 4 °C.
   5. Pour les échantillons « 30 min », centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 200 µl de PBS contenant 2 % de BSA. Incubez 30 min à 37 °C. Suivez les étapes 1.7.3-1.7.4 et conservez les échantillons à 4 °C.
      REMARQUE : Pour le contrôle à l'azoture de sodium : utilisez du PBS supplémenté de 2 % de BSA et 0,1 % d'azoture de sodium pour l'incubation de 30 min à 37 °C.
   6. Pour les échantillons « 30 min + STV », centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 200 µl de PBS contenant 2 % de BSA. Incubez 30 min à 37 °C. Ensuite, centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension les culots dans 50 µl de STV (utilisez la concentration déterminée à la section 3) diluée dans du PBS contenant 2 % de BSA et 0,1 % d'azoture de sodium (afin d'empêcher l'internalisation pendant la manipulation de l'échantillon). Incubez 30 min sur de la glace. Suivez les étapes 1.7.3-1.7.4 et conservez les échantillons à 4 °C.
      REMARQUE : Pour le contrôle à l'azoture de sodium : utilisez du PBS supplémenté de 2 % de BSA et 0,1 % d'azoture de sodium pour l'incubation de 30 min à 37 °C.
8. Pour la perméabilisation, centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 100 µl de PBS contenant 0,5 % de Triton X-100. Incubez pendant 6 min à température ambiante. Ensuite, répétez l'étape de lavage décrite à l'étape 1.6).
9. Centrifugez les tubes à 4 °C pendant 3 min à 450 x g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 50 µl de 2 % de BSA diluée dans du PBS contenant STV-Cy3. (Veuillez noter que la concentration appropriée de STV-Cy3 doit être déterminée avant le début de l'expérience. Commencez avec une concentration de 1:200 et testez des dilutions deux fois plus faibles jusqu'à 1:2 400. Selon nos résultats, une dilution de 1:1 000 s'est révélée optimale.)
10. Incubez 1 h à l'abri de la lumière à température ambiante. Ensuite, répétez l'étape de lavage décrite à l'étape 1.6, mais remettez le culot en suspension dans 200 µl de 2 % de BSA diluée dans du PBS.
11. Analysez les échantillons par cytométrie en flux. Déterminez le pourcentage de cellules positives au Cy3 dans chaque échantillon.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Life Technologies	41966-052
SFB	Life Technologies	10270-106
Pénicilline-Streptomycine	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sucrose	Fluka	84100
Bio Essai de Protéines Bio Rad	Bio Rad	500-0006
Tubes profonds (microtubes de 1,2 ml)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
Tubes d'ultracentrifugation	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
Azide de sodium	Fluka	71290
Neuraminidase/sialidase bactérienne	Sigma-Aldrich	N6514-1UN