Évaluation de l'inhibition de la croissance bactérienne médiée par les phages à l'aide de mesures de densité optique

Résumé

Source : Niu, Y. D., et al. Efficacité des bactériophages pour la lutte biologique contre les agents pathogènes transmissibles par les aliments évaluée par des dispositifs à haut débit. J. Vis. Exp. (2021)

Ce vidéo montre un test basé sur des microplaques permettant d'évaluer l'activité lytique de cocktails de phages contre des cultures bactériennes de E. coli. Elle met en évidence comment les variations de densité optique révèlent la puissance du phage et la concentration nécessaire pour obtenir une inhibition bactérienne complète.

Protocole

1. Préparation du tampon et des réactifs

1. Préparer 500 mL de bouillon tryptique soja (TSB) (15 g de poudre de TSB et 500 mL d'eau ultrapure) et stériliser au autoclave.
   REMARQUE : Ce milieu peut être conservé à température ambiante jusqu'à 3 mois ou à 4 °C pendant 6 mois maximum.
2. Préparer 500 mL d'agar tryptique soja (TSA) (20 g de poudre de TSA et 500 mL d'eau ultrapure) et stériliser au autoclave.
   REMARQUE : Ce milieu peut être conservé à 4 °C pendant 3 mois maximum.
3. Préparer 500 mL de solution tampon phosphate (PBS ; 4 g de NaCl, 0,1 g de KCl, 0,77 g de Na₂HPO₄ et 0,12 g de KH₂PO₄, 500 mL d'eau ultrapure), mesurer et ajuster le pH à 7,2 ± 0,2 à 25 °C, puis stériliser au autoclave.
   REMARQUE : Cette solution peut être conservée à 4 °C pendant 6 mois maximum.
4. Préparer 200 mL de MgSO₄ à 1 M (49,294 g et 200 mL d'eau ultrapure) et stériliser par filtration sur filtre en polyéthersulfone de 0,22 µm.
5. Préparer 500 mL de TSB contenant du MgSO₄ à 10 mM (mTSB ; 15 g de poudre de TSB, 500 mL d'eau ultrapure et 5 mL de MgSO₄ à 1 M) et stériliser au autoclave ; laisser refroidir le milieu stérilisé à température ambiante. Appliquer une technique aseptique. À l’aide d’une pipette sérologique, transférer soigneusement 5,0 mL de MgSO₄ à 1 M ; agiter doucement pour homogénéiser.

2. Préparation de la culture bactérienne

1. Pour préparer la culture bactérienne de laboratoire (BRLC), retirez le(s) flacon(s) de stock glycérolé de l'inventaire du congélateur et transférez-les en laboratoire.
2. Utiliser une anse de prélèvement jetable ou équivalente, l’insérer dans le flacon, prélever un échantillon d’inoculum (pâte gelée) et le strier sur une boîte de TSA ou équivalente à l’intérieur d’une cabine de sécurité biologique de niveau II. Incuber la boîte à 37 °C ± 2 °C pendant 15 à 18 h.
3. Placer les plaques BRLC préparées dans un sachet et conserver à 4 °C.
   REMARQUE : Période générale de péremption du BRLC : 14 jours à 4 °C après la génération.
4. Inoculer une colonie unique de chacune E. coli souche O157 provenant des plaques BRLC à tester dans 10 mL de TSB et incuber statiquement à 37 °C pendant 18 h afin d'atteindre 9 log10 UFC/mL.
5. Préparer une dilution sérielle des cultures de la nuit (le lendemain matin), chacune E. coli souche O157 en utilisant du mTSB contenant 10 mM de MgSO₄₄ pour atteindre 4-5 log10 UFC/ml (ou un autre niveau d'inoculum souhaité).
6. Mélanger un volume égal de culture sur une nuit de chaque souche afin d'obtenir un total de 4 à 5 log10 UFC/mL (ou selon les besoins) pour préparer le mélange bactérien.
7. Placer immédiatement la culture bactérienne diluée à 4 °C en attente d'utilisation.
8. Diluer la culture inoculée par un facteur 10 ou 100 et ensemencer 0,1 mL d'aliquote de ces dilutions sur des géloses TSA afin d'obtenir des colonies isolées.

3. Préparation des solutions de travail de phage

1. Propager des stocks de travail à titre élevé pour chaque phage à analyser (≥108 PFU/mL) en suivant les méthodes standard4.
   REMARQUE : La durée de conservation générale des stocks de phages est de 3 mois dans un flacon en plastique à 4 °C après leur préparation.
2. Pour obtenir le titre souhaité, par exemple ~10⁸ PFU/mL pour la cinétique de lyse, diluer les préparations individuelles de phages avec du mTSB contenant 10 mM de MgSO₄. Préparer les mélanges de phages en mélangeant des volumes égaux de chaque stock de travail ayant le même titre, selon toutes les combinaisons possibles.

4. Préparation de la cinétique de lyse in vitro pour les phages individuels et les cocktails de phages

1. Préparer des dilutions sérielles au dixième de chaque phage dans les colonnes 1 à 8 dans des microplaques stériles de 96 puits afin de mettre en place le test en microplaque.
   REMARQUE : Quatre phages dirigés contre une souche bactérienne peuvent être testés en double, dans des colonnes adjacentes, sur chaque plaque. Les quatre colonnes restantes sont destinées aux témoins, sans phage, ainsi qu'au témoin mTSB (Figure 1).
2. Placer 180 µL de mTSB dans les puits des colonnes 1 à 12 de la microplaque de 96 puits.
3. Ajouter 20 µL de phages individuels dilués ou de cocktails de phages (~108 PFU/mL) dans les puits 1 à 8 de la première rangée de la microplaque (rangée A).
4. Pour les témoins sans phage et le témoin blanc, ajouter 20 µL de mTSB dans le puit supérieur des colonnes 9, 10 et 11.
5. Avec une pipette à 12 canaux, effectuer la dilution dans la plaque. Transférer 20 µL d'une rangée à l'autre. Bien mélanger le contenu par aspirations et expulsions répétées et douces (au moins cinq fois), et changer les embouts entre chaque dilution. Retirer 20 µL de la dernière rangée (rangée H).
   REMARQUE : L'utilisation d'embouts avec filtre est recommandée pour éviter la contamination croisée.
6. Préparer un réservoir pour chaque souche. Utiliser une pipette de 1 mL pour transférer 2-3 mL de la culture diluée dans le réservoir. Pour les colonnes 1 à 10, utiliser une pipette multicanal pour ajouter 20 µL de la culture bactérienne diluée dans chaque puit. Changer les embouts entre chaque ajout.
7. Couvrir et incuber la microplaque dans les conditions souhaitées (par exemple, 37 °C pendant 10 h ou 22 °C pendant 22 h).
8. Toutes les 2 h ou à d'autres intervalles souhaités, sortir les microplaques de l'incubateur.

Résultats

Figure 1 : Agencement suggéré pour le test en microplaque de 96 puits. Des dilutions sérielles décimales de chaque phage sont préparées dans les colonnes 1 à 8 de microplaques stériles de 96 puits. Quatre phages dirigés contre une souche bactérienne peuvent être testés en double, dans des colonnes adjacentes, sur chaque plaque. Les colonnes restantes sont destinées aux témoins.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériel, réactifs et équipements essentiels
Sulfate de magnésium heptahydraté	Sigma	1374361
Pipette Pipet-Lite LTS L-1000XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipette Pipet-Lite LTS L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipette multipipette Pipet-Lite LTS L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipette Pipet-Lite, universelle SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
Embouts de pipette RT LTS 1000µL FL 768A/8 — faible rétention	METTLER TOLEDO	30389213
Embouts de pipette SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
Réservoir	METTLER TOLEDO	89094-662
Plaques microtitration en polystyrène stériles, transparentes, à 96 puits, à fond plat, avec couvercles	Fisher	168055
Agar tryptic soya (TSA)	Sigma	105458-0500
Bouillon tryptic soya (TSB)	Sigma	105459-0500
Étendeurs cellulaires en forme de T	VWR	76299-566
Instruments
Incubateurs microbiologiques compacts	Fisher	50125590H
Barreaux d'agitation polygonaux	FIsher	14-512-125	longueur : 20 mm
Lecteur multifonction hybride Synergy Neo2	Fisher	BTNEO2M
Logiciels
SAS	SAS Institute	9.4