Marquage des génomes de l'HSV-1 en cours de réplication avec un analogue nucléosidique

Résumé

Source : Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purification de l'ADN viral pour l'identification des protéines virales et cellulaires associées. J. Vis. Exp. (2017)

Ce vidéo montre l'infection de cellules de mammifères en phase stationnaire par le HSV-1 (virus de l'herpès simplex de type 1), suivie de la réplication du génome viral à l'aide des machineries de réplication de l'hôte et du virus. Un analogue synthétique de nucléoside est incorporé dans l'ADN viral nouvellement synthétisé afin de marquer les génomes en cours de réplication, qui sont ensuite isolés pour une analyse protéomique des protéines virales et cellulaires associées.

Protocole

1. Culture cellulaire, infection virale et marquage par EdC (5-éthynyl-2′-désoxycytidine) (Figure 1)

Le protocole suivant implique un travail avec des virus. Veuillez vous référer aux protocoles de biosécurité de votre établissement concernant la manipulation sécuritaire des virus et autres agents biologiques. Ce protocole a été approuvé par le comité d'éthique de l'Université de Pittsburgh.

1. Détacher par trypsine des cellules MRC-5 (souche cellulaire du Medical Research Council 5) issues d’un flacon de culture tissulaire de 150 cm² confluent et transférer les cellules dans une plaque de culture tissulaire de 600 cm² contenant 100 mL de milieu DMEM (milieu de Dulbecco modifié d’Eagle) complété avec 10 % de SFB. Incuber à 37 °C en présence de 5 % de CO2 pendant 3 à 4 jours jusqu’à obtention de la confluence et de la phase stationnaire. Une plaque de 600 cm² confluent contient environ 7 x 107 cellules. Préparer une plaque pour chaque condition expérimentale et une plaque pour chaque contrôle négatif correspondant.² flacon de culture de cellules MRC-5 (souche cellulaire Medical Research Council 5) et transférer les cellules dans une plaque de culture tissulaire de 600 cm² contenant 100 mL de DMEM (milieu de Dulbecco modifié par Eagle) complété avec 10 % de SBF. Incuber à 37 °C en présence de 5 % de CO₂₂ pendant 3 à 4 jours afin d'atteindre la confluence et la phase stationnaire. Une boîte de 600 cm² confluentes contient environ 7 x 10⁷ Préparer 1 plaque pour chaque condition et 1 plaque pour chaque contrôle négatif correspondant.
   REMARQUE : Les cellules doivent atteindre la phase stationnaire afin d'inhiber la réplication de l'ADN cellulaire, garantissant ainsi que seul l'ADNv (ADN viral) soit marqué et purifié lors des étapes ultérieures.
   REMARQUE : Chaque échantillon nécessite un contrôle négatif non marqué complémentaire, préparé dans les mêmes conditions d'infection et au même point temporel, sans ajout d'EdC.
   REMARQUE : Une version réduite de cette expérience doit être réalisée en parallèle afin de tester le marquage de l'ADN cellulaire par imagerie, en utilisant des conditions comparables de croissance cellulaire, d'infection, de marquage par EdC et de points temporels (voir Étape 2).
2. Diluer 7 x 10⁸ PFU (unités formant des plaques) HSV-1 dans 7 mL de solution saline tamponnée au Tris (TBS) froide. Retirer le milieu de croissance et conserver à 37 °CPour infecter, ajouter le virus dilué (7 mL) aux cellules MRC-5 et agiter pendant 1 heure à température ambiante. Après adsorption, retirer l'inoculum, rincer avec 50 mL de TBS à température ambiante et remplacer par le milieu de croissance initial. Incuber à 37 °C en présence de 5 % de CO₂₂Cette étape doit être réalisée pour chaque condition expérimentale et chaque contrôle négatif.
   REMARQUE : Une étiquetage accru par l'EdC peut être obtenu en utilisant des mutants du VHS-1 déficients pour l'expression de la dUTPase virale (gène UL50) et/ou de l'uracile glycosylase (gène UL2). La dUTPase du VHS-1 présente une faible spécificité de substrat et peut diminuer l'activation de plusieurs analogues de nucléosides.
3. Marquer les génomes viraux avec l'EdC. Suivre les instructions pour marquer les génomes entrants (1.3.1.), les génomes en cours de réplication (1.3.2.) ou les fourches de réplication virale (1.3.3.).
   REMARQUE : Seule l'étape 1.3.1, 1.3.2 ou 1.3.3 doit être réalisée selon que les génomes entrants, les génomes répliqués ou les fourches de réplication doivent être analysés aux étapes suivantes, respectivement.
   REMARQUE : L'EdU ou le f-ara EdU peuvent être substitués à l'EdC. La toxicité des analogues de nucléosides doit être surveillée et minimisée.
   1. Utiliser des stocks prémarqués pour réaliser l'infection à l'étape 1.2 et passer à l'étape 2 ou 3 dans les 4 heures suivant l'infection (hpi) afin d'étudier l'ADNv non répliqué (Figure 1A).
      REMARQUE : Préparer des stocks de virus prémarqués en utilisant le protocole décrit précédemment25. Les stocks de virus doivent être passés à travers une colonne G-25 afin d'éliminer tout EdC résiduel.
   2. Marquer l'ADNv en réplication en ajoutant 5 - 25 µM EdC au milieu de culture des cellules infectées pendant 2 à 4 h (Figure 1B). Avant l'ajout, diluer l'EdC dans 1 mL de milieu de croissance.
   3. Pour étiqueter les fourches de réplication virales, après le début de la réplication de l'ADNv (≥ 4 hpi), étiqueter en pulse l'ADNv en cours de réplication avec 5 - 25 µM d'EdC pendant 5-20 min. Pour le chase, rincer 3 fois avec un milieu de chase contenant 25 - 100 µM de 2′-déoxycytidine (désoxyC), puis incuber en présence de ce milieu de chase pendant 20-40 min supplémentaires (Figure 1C). 25 µM EdC pendant 5 à 20 min. Pour la phase de chasse, rincer 3 fois avec le milieu de chasse contenant 25 - 100 µM 2´déoxycytidine (deoxyC), puis incuber en présence du milieu de chase pendant 20 à 40 min supplémentaires (Figure 1C).
      REMARQUE : Le milieu de pulse et de chase doit être équilibré à 37 °C et 5 % de CO₂₂ avant utilisation.
      REMARQUE : Pour les expériences de type « pulse-chase », il est important de prendre en compte le temps nécessaire à l'entrée des nucléosides dans la cellule et à leur phosphorylation avant qu'ils ne puissent être incorporés dans l'ADN en cours de réplication. Ce délai doit être déterminé empiriquement.
      REMARQUE : Pour déterminer la résolution des expériences de pulse-chase, calculez le taux de réplication virale dans les conditions expérimentales utilisées. Celui-ci peut être déterminé par une PCR quantitative des génomes viraux au cours d'une cinétique de croissance en une seule étape.

Résultats

Figure 1 : Approches pour marquer l'ADN du VHS-1. (A) Pour analyser l'état du virus entrant, des cellules MRC-5 en repos en phase G0 sont infectées avec un VHS-1 préalablement marqué, et les génomes sont analysés moins de 4 heures après l'infection (hpi) afin d'étudier l'ADN viral non répliqué. (B) Pour analyser l'état du virus répliqué, des cellules MRC-5 sont infectées avec un VHS-1 non marqué et du EdC (étoiles oranges) est ajouté au milieu de culture des cellules infectées, puis incubé pendant 2 à 4 heures après le début de la réplication de l'ADN viral (≥4 hpi). (C) Pour analyser les fourches de réplication virales, les cellules infectées sont marquées de façon pulsée avec du EdC pendant 5 à 20 minutes. Les fourches de réplication peuvent ensuite être poursuivies (chase) avec du deoxyC. L'ADN marqué avec du EdC apparaît en orange. Cette figure a été modifiée d'après Dembowski et DeLuca

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules MRC-5	ATCC	CCL-171
Sérum de veau fœtal (FBS)	Gibco	26140-179
Milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)	Gibco	12800-082	Substitué par 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 12 mM (pour la culture en flacon) ou 30 mM (pour la culture en boîte) de bicarbonate de sodium
Boîte de culture tissulaire de 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
Solution saline tamponnée au Tris (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
Stock de HSV-1			Les stocks ayant des titres supérieurs à 1x10⁹ PFU/mL donnent les meilleurs résultats
5´-Éthynyl-2´-désoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissoudre dans du DMSO pour préparer un stock à 40 mM, aliquoter et conserver à -20 °C
Incubateur de culture cellulaire
Hotte de sécurité biologique
Blocs chauffants			65 °C et 95 °C