Isolement de protéines à partir de complexes ADN viral-protéine

Résumé

Source : Dembowski, J. A., et al. Purification de l'ADN viral pour l'identification de protéines virales et cellulaires associées. J. Vis. Exp. (2017).

Ce vidéo montre l'isolement de complexes ADN viral–protéines à partir de noyaux cellulaires à l'aide de la chimie click et de la purification par billes magnétiques. Le protocole consiste à marquer les génomes viraux avec des nucléotides modifiés par un alcyne, à les biotinylater par une réaction click, puis à les lier à des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Après lavage et élution thermique, les complexes purifiés sont récupérés, congelés rapidement et stockés en vue d'analyses ultérieures.

Protocole

1. Purification de l'ADNv et des protéines associées

REMARQUE : Tous les tampons et réactifs doivent être refroidis sur de la glace avant utilisation, et toutes les étapes doivent être effectuées sur de la glice, sauf indication contraire.

1. Récupérer les noyaux. REMARQUE : Avant l'isolement des noyaux, du formaldéhyde peut être utilisé pour réticuler les protéines à l'ADN. Des conditions de lavage plus strictes peuvent ensuite être appliquées lors de la purification de l'ADN sur des billes revêtues de streptavidine.
   1. Remplacer le milieu de croissance par 20 mL de tampon d'extraction des noyaux (NEB) et incuber 20 min à 4 °C avec un léger basculement occasionnel. Les noyaux deviendront visibles au microscope.
   2. Gratter les noyaux depuis la plaque à l’aide d’un grattoir à cellules et les transférer dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger 10 min à 2 500 x g à 4 °C pour former un culot de noyaux, puis jeter le surnageant.
      REMARQUE : Une coloration au bleu de trypan peut être utilisée pour vérifier l’isolement des noyaux à partir des cellules.
   3. Redisperser délicatement le culot nucléaire dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), transférer dans un tube conique de 15 mL, puis centrifuger 10 min à 2 500 x g à 4 °C pour former un culot. Éliminer complètement le PBS.
      REMARQUE : Les noyaux peuvent être congelés, et le protocole peut être interrompu à ce stade. Pour cela, redisperser délicatement le culot nucléaire dans 500 µL de tampon de congélation et placer le tube dans un bain d’éthanol/glace sèche. Conserver les noyaux congelés à -80 °C. Avant utilisation, décongeler les noyaux à température ambiante, les transférer rapidement sur de la glace, ajouter 10 mL de PBS, agiter doucement pour homogénéiser, centrifuger 10 min à 2 500 x g à 4 °C, puis éliminer complètement le PBS. La congélation des noyaux peut entraîner une réduction du rendement.
2. Conjuguer covalemment la biotine-azide à l’ADN viral marqué par l’5-éthynyl-2′-désoxycytidine (EdC) ou vADN.
   1. Redisperser le culot nucléaire dans 10 mL de mélange de réaction « click » [voir Tableau des matériaux] en pipetant doucement 5 fois avec une pipette de 10 mL.
      REMARQUE : Il est important que les réactifs inclus dans le mélange de réaction « click » soient ajoutés dans l’ordre indiqué.
   2. Agiter rotativement pendant 1 h à 4 °C. Pendant l’agitation, préparer et refroidir les tampons B1, B2 et B3 [voir Tableau des matériaux].
   3. Centrifuger pour former un culot de noyaux pendant 10 min à 2 500 x g à 4 °C. Éliminer complètement le mélange de réaction « click » et laver le culot en redispersant doucement dans 10 mL de PBS, puis centrifuger 10 min à 2 500 x g à 4 °C.
   4. Redisperser délicatement le culot nucléaire dans 1 mL de PBS et le transférer dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL à l’aide d’une pipette à embout large. Centrifuger pour former un culot de noyaux pendant 10 min à 2 500 x g à 4 °C. Éliminer complètement le PBS et congeler instantanément dans de l’azote liquide.
      REMARQUE : Le protocole peut être interrompu à ce stade, et les noyaux congelés peuvent être conservés à -80 °C. Le cycle de congélation-décongélation facilite la lyse ultérieure, il est donc recommandé de congeler rapidement les noyaux même si l’on passe directement à l’étape 1.3 le même jour.
3. Lysér les noyaux et fragmenter l’ADN.
   1. Décongeler les noyaux sur de la glace et les redisperser dans 500 µL de tampon B1 par pipetage. Incuber sur de la glace pendant 45 min.
   2. Soniquer les échantillons 6 fois, 30 s chacun, à 40 % d’amplitude, en utilisant une sonde microtip de 3 mm. Placer les échantillons sur de la glace pendant 30 s entre chaque impulsion. Après la sonication, les échantillons doivent apparaître clairs, non troubles.
      REMARQUE : Les conditions de sonication doivent être optimisées pour chaque sonicateur.
   3. Centrifuger les débris cellulaires à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C. La taille du culot devrait diminuer considérablement. Filtrer le surnageant à travers un tamis cellulaire de 100 µm et conserver l’écoulement.
   4. Ajouter 500 µL de tampon B2 au surnageant filtré. 900 µL de cet échantillon seront utilisés à l’étape 1.4.2.
   5. Prélever un aliquot de chaque condition pour l’isolement de l’ADN (50 µL ou 1/20e du volume) et ajouter 50 µL de solution bicarbonate de sodium dodécylsulfate (SDS) 2x [voir Tableau des matériaux]. Passer au protocole d’isolement de l’ADN.
   6. Prélever un aliquot de chaque condition pour la protéine témoin (50 µL ou 1/20e du volume) et ajouter 50 µL de tampon d’échantillonnage Laemmli 2x, congeler dans de l’azote liquide, puis conserver à -80 °C.
4. Lier l’ADN biotinylé aux billes revêtues de streptavidine.
   1. Préparer les billes magnétiques Streptavidin T1 en transférant 300 µL de suspension de billes dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Préparer un tube de billes par échantillon. Laver les billes 3 fois avec 1 mL de tampon B2 en vortexant pour les redisperser, en appliquant un aimant pour séparer les billes, puis en aspirant le tampon de lavage.
      REMARQUE : Des conditions de liaison optimisées permettent un rendement maximal et une liaison non spécifique minimale. Il a été déterminé expérimentalement que les billes magnétiques Streptavidin T1 ont une capacité de liaison significativement supérieure à celle des billes d’agarose, ainsi qu’à d’autres billes de streptavidine, et une liaison de fond plus faible que les billes Streptavidin C1 (Figure 1A).
   2. Ajouter 900 µL de l’échantillon de l’étape 1.3.4. aux billes lavées et agiter rotativement toute la nuit à 4 °C.
      REMARQUE : Ne pas vortexer les billes une fois l’échantillon ajouté.
      REMARQUE : Si des quantités importantes d’ADN ou de protéine sont isolées dans le contrôle négatif non marqué, cette étape peut être réduite de toute la nuit à 4 h afin de diminuer la liaison de fond.
5. Laver les billes et éluer l’ADN viral et les protéines associées.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des pointes filtrantes pour les étapes restantes.
   1. Placer les échantillons dans un support magnétique pour tubes microcentrifuge, éliminer le surnageant, redisperser délicatement dans 1 mL de tampon B2, puis agiter rotativement à 4 °C pendant 5 min.
   2. Répéter l’étape 1.5.1 trois fois.
   3. Placer les échantillons dans un support magnétique pour tubes microcentrifuge, éliminer le surnageant, redisperser délicatement dans 1 mL de tampon B3, puis agiter rotativement à 4 °C pendant 5 min.
   4. Transférer 100 µL du mélange de billes (1/10e du volume) dans un nouveau tube pour l’isolement de l’ADN lié. Appliquer l’aimant, éliminer le surnageant, redisperser les billes dans 100 µL de solution SDS ou solution bicarbonate de sodium 1x, puis passer au protocole d’isolement de l’ADN.
   5. Appliquer l’aimant au tube contenant les 900 µL restants du mélange de billes de l’étape 1.5.3., éliminer le surnageant, puis redisperser les billes dans 50 µL de tampon d’échantillonnage Laemmli 2x pour éluer les protéines et les complexes ADN-protéine.
   6. Faire bouillir les échantillons à 95 °C pendant 15 min, vortexer, centrifuger rapidement, puis appliquer l’aimant. Transférer l’éluat dans un nouveau tube, congeler instantanément et conserver à -80 °C.
      REMARQUE : Utiliser des bouchons vissés pour s’assurer que les tubes ne s’ouvrent pas pendant l’ébullition.
      REMARQUE : Le protocole peut être interrompu à ce stade, et les échantillons peuvent être conservés à -80 °C pendant plusieurs semaines.
   7. Analyser les échantillons protéiques par coloration au bleu de Coomassie, immunotransfert (western blotting) ou spectrométrie de masse selon les procédures classiques. Des résultats représentatifs sont présentés dans les Figures 1 et 2.
      REMARQUE : Pour déterminer si le rendement protéique est suffisant pour la spectrométrie de masse, 7,5 µL de chaque échantillon sont analysés par coloration au bleu de Coomassie et 7,5 µL par immunotransfert d’une protéine virale associée représentative (ICP4, ICP8 ou UL42). Le même volume de lysats de l’étape 1.3.6. est analysé en parallèle pour contrôler les niveaux de protéine témoin. Le reste de l’échantillon (35 µL) est ensuite analysé par spectrométrie de masse.

Résultats

Figure 1 : Résultats représentatifs de la purification des protéines. (A) Comparaison du rendement protéique lorsque les étapes de purification ont été réalisées à l'aide de plusieurs types différents de billes revêtues de streptavidine. L'infection a été réalisée en présence de EdC (+) pour comparer le rendement protéique ou en l'absence de EdC (-) pour comparer la liaison non spécifique. Les infections et le marquage par EdC ont été réalisés, et les complexes ADN-protéines ont été purifiés à l'aide de quantités comparables de différents types de billes revêtues de streptavidine. Panneau supérieur : comparaison du rendement protéique après purification sur billes d'agarose revêtues de streptavidine ou sur billes Streptavidin M-280. Panneau inférieur : comparaison du rendement protéique après purification sur billes Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 ou Streptavidin T1. Un immunoblot a été réalisé avec un anticorps dirigé contre la protéine virale ICP4. L'ICP4 purifiée est présentée dans la première piste à titre comparatif. Une exposition plus longue du panneau inférieur a été nécessaire pour observer une intensité similaire d'ICP4 dans la piste "280" comme dans le panneau supérieur. (BDes résultats représentatifs de purification protéique en fonction de la durée de marquage par l'EdC sont présentés. Des infections et un marquage par l'EdC ont été réalisés, puis les complexes ADN-protéine ont été purifiés à l'aide de billes de streptavidine T1. Le marquage par l'EdC a été effectué pendant 0, 20, 40 ou 60 minutes, et les résultats de la coloration au bleu de Coomassie (haut) et du western blot (bas) sont montrés. Le western blot a été réalisé avec des anticorps spécifiques dirigés contre ICP4, UL42 ou GAPDH. L'échantillon d'élution provient de l'étape 1.5.5. et le lysat de l'étape 1.3.6. La flèche indique la streptavidine, tandis que L indique l'échelle de masses protéiques.

Figure 2 : Exemples de différentes façons de présenter les données de protéomique. (A) Des camemberts résument les protéines identifiées par spectrométrie de masse des éluats protéiques associés aux génomes viraux purifiés à 6 hpi. Les valeurs indiquent le nombre de protéines identifiées pour chaque catégorie fonctionnelle. T indique le nombre total de protéines identifiées. Les couleurs représentent les catégories suivantes : violet – traitement de l'ARN, rouge – transcription, vert – remodelage de la chromatine, orange – réplication de l'ADN, jaune – transport nucléaire, turquoise – cytosquelette, bleu foncé – protéines structurelles du VHS, et gris – autre/inconnu. (B) Des diagrammes de Venn montrent la superposition des protéines identifiées comme étant associées aux génomes viraux à 6, 8 ou 12 hpi. (C) Une carte STRING illustre les protéines enrichies sur les fourches de réplication virales après un pulse de 5 minutes avec l'EdC. Les protéines humaines enrichies d'au moins 5 fois par rapport au témoin négatif non marqué sont représentées sur la carte d'interactions fonctionnelles, générée à l'aide de STRING avec des paramètres de données affichant uniquement les interactions de haute confiance. Les noms des gènes ont été utilisés pour cartographier les interactions. Les cercles indiquent des protéines intervenant dans le même processus biologique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules MRC-5	ATCC	CCL-171
Sérum de veau fœtal (FBS)	Gibco	26140-179
Milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)	Gibco	12800-082	Substitué par 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 12 mM (pour la culture en flacon) ou 30 mM (pour la culture en boîte) de bicarbonate de sodium
Boîte de culture tissulaire de 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
Solution tamponnée au Tris (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
Stock de HSV-1			Les stocks ayant des titres supérieurs à 1x10⁹ PFU/mL donnent les meilleurs résultats
Colonne Sephadex G-25 (colonne de désalinisation PD-10)	GE Healthcare	17085101
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Éthynyl-2´-déoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissoudre dans du DMSO pour préparer un stock à 40 mM, aliquoter et conserver à -20 °C
2´-Déoxycytidine (déoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Dissoudre dans de l'eau pour préparer un stock à 40 mM, aliquoter et conserver à -20 °C
Buffer d'extraction nucléaire (NEB)			Préparer frais (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 300 mM saccharose, 0,5 % Igepal)
Spalter cellulaire	Bellco glass	7731-22000	Autoclaver avant utilisation
Solution de bleu de trypan	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7,2 (10x)			1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ (diluer à 1x dans de l'eau stérile avant utilisation)
Sulfate de cuivre (II) pentahydraté (CuSO₄·5H₂O)	Fisher Scientific	C489	Préparer un stock à 100 mM et conserver à 4 °C pendant un mois maximum
(+) L-ascorbate de sodium	Sigma-Aldrich	A4034	Préparer fraîchement un stock à 100 mM et conserver sur glace jusqu'à l'utilisation
Azoture de biotine	Invitrogen	B10184	Préparer un stock à 10 mM dans du DMSO, aliquoter et conserver à -20 °C pendant un an maximum
Mélange de réaction « click »			Préparer immédiatement avant utilisation en ajoutant les réactifs dans l'ordre indiqué (10 mL : 8,8 mL de PBS 1x, 200 µL de CuSO₄ 100 mM, 25 µL d'azoture de biotine 10 mM, 1 mL d'ascorbate de sodium 100 mM)
Cocktail complet d'inhibiteurs de protéase	Roche	11697498001	Dissoudre dans 1 mL d'eau pour préparer un stock 50x, peut être conservé à 4 °C pendant une semaine maximum, ou ajouter directement 1 comprimé à 50 mL de tampon
Tampon de congélation			Préparer frais (7 mL de glycérol 100 %, 3 mL de NEB, 200 µL d'inhibiteur de protéase 50x)
Buffer B1			Préparer frais (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1 % Igepal, inhibiteur de protéase 1x)
Buffer B2			Préparer frais (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 % Igepal, inhibiteur de protéase 1x)
Buffer B3			Préparer frais (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, inhibiteur de protéase 1x)
Procédeur ultrasonique Vibra Cell équipé d'une sonde microtip de 3 mm	Sonics	VCX 130
Filtre cellulaire	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidine T1	Life Technologies	65601
AIMANT DynaMag-2	Life Technologies	12321D
Rotateur de mini-tubes	Fisher Scientific	260750F
Buffer d'échantillonnage 2x Laemmli			Mélanger 400 mg de SDS, 2 mL de glycérol 100 %, 1,25 mL de Tris 1 M (pH 6,8) et 10 mg de bleu de bromophénol dans 8 mL d'eau. Conserver à 4 °C pendant six mois maximum. Avant utilisation, ajouter du DTT 1 M pour obtenir une concentration finale de 200 mM.
Bouchons pour tubes de 1,5 mL	Fisher Scientific	NC9679153
Réactifs standards pour immunotransfert
Kit de coloration bleue colloïdale NOVEX	Invitrogen	LC6025
Boîte de culture tissulaire 12 puits	Corning	3513
Couvre-objets	Fisher Scientific	12-545-100	Autoclaver avant utilisation
Lames de microscope	Fisher Scientific	12-552-5
Parafomaldehyde à 16 %	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluer à 3,7 % dans du PBS 1x avant utilisation
Albumine de sérum bovin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	Préparer à 3 % dans du PBS 1x
Tampon de perméabilisation (0,5 % Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	Préparer 0,5 % de Triton-X 100 dans du PBS 1x
Cocktail de réaction « click » - Kit Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging	Molecular Probes	C10337	Préparer selon le protocole du fabricant
Solution bicarbonate-SDS 2x			2 % SDS, 200 mM NaHCO₃
Tris EDTA (TE) 10x, pH 8,0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (diluer à 1x avant utilisation)
Microcentrifugeuse pour tubes de 1,5 mL
Centrifugeuse de table pour tubes de 15 et 50 mL
Incubateur de culture cellulaire
Cabinet de sécurité biologique
Blocs chauffants			65 °C et 95 °C