Un dispositif recouvert de silicone imprimé en 3D pour modéliser une infection des voies urinaires associée à un cathéter

Résumé

Source:
Ocean E. Clarke¹, Romy A. Dop¹, Tom Hasell¹, Joanne L. Fothergill¹, Daniel R. Neill<sup>2

1</sup>Université de Liverpool, ² Université de Dundee

Cette vidéo démontre l’utilisation d’un dispositif imprimé en 3D, recouvert de silicone, qui imite la surface interne des cathéters urinaires pour simuler une infection des voies urinaires associée aux cathéters.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d’échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l’IRB de l’institut.

1. Fabrication additive des modèles Flexipeg

1. Imprimez les chevilles (24 chevilles nécessaires par couvercle de cheville) et les couvercles de chevilles dans une résine stable à haute température à l’aide de la stéréolithographie (hauteur de couche de 100 μm).
   NOTE: Une résine stable à haute température est utilisée pour les chevilles, et les couvercles des chevilles peuvent être stérilisés au autoclave avant l’expérimentation.
2. Imprimez en 3D les composants du moule et les pièces du support du tube à essai à l’aide de la modélisation par dépôt de fil fondu (FDM) avec un remplissage de 60 %.
   NOTE: Toute résine durable convient au FDM, car les moules et les portoirs de tubes à essai peuvent être stérilisés à l’éthanol et ne nécessitent pas de stabilité à haute température.
3. Assurez-vous que les composants du modèle ont été imprimés correctement et éliminez tout résidu en excès du processus d’impression en utilisant de l’éthanol à 70 %.
4. Assemblez le moule du tapis en silicone comme illustré à la figure 1, en maintenant les côtés en place avec du ruban adhésif si nécessaire.

2. Préparation du modèle Flexipeg

1. Préparation du tapis en silicone
   1. Pesez 18 g de base de silicone (base 10:1 pour catalyseur polydiméthylsiloxane (PDMS), durcissement par condensation) dans un bécher et mélangez doucement 2 g de catalyseur jusqu’à ce que le tout soit bien mélangé.
      NOTE: Évitez de trop agiter le mélange de silicone pour éviter la formation de bulles à l’intérieur du moule.
   2. Versez le mélange de silicone combiné dans le moule imprimé FDM, en essuyant tout excès de mélange de silicone sur les côtés et le haut du moule. Laisser durcir toute la nuit (un minimum de 18 h) à température ambiante (RT).
   3. Retirez le tapis du moule et coupez tout excès de silicone sur les côtés. Assurez-vous que le tapis s’insère dans le couvercle de la cheville, comme illustré à la Figure 1.
2. Revêtement de cheville
   1. Insérez les piquets dans un tapis en silicone (24 piquets par tapis) et fixez le tapis au couvercle du piquet ou à un plateau en plastique de dimensions similaires au tapis à l’aide de ruban adhésif.
   2. Pesez 27 g de base de silicone dans un plateau en plastique peu profond (environ les mêmes dimensions qu’une plaque de 96 puits) et mélangez soigneusement 3 g de catalyseur jusqu’à ce que le tout soit bien mélangé.
   3. Retournez les couvercles des chevilles de manière à ce qu’elles soient tournées vers le bas, et trempez immédiatement les chevilles dans le mélange de silicone. Retournez le couvercle de la cheville et laissez l’excès de silicone s’égoutter sur les chevilles et les chevilles durcir toute la nuit à température ambiante.
      NOTE: Le silicone à durcissement rapide (6 à 8 h de durcissement complet ; 40 à 60 min de temps de travail) continuera à s’égoutter avant de durcir ; par conséquent, il n’est pas impératif d’enrober toute la cheville de PDMS lors du trempage, car tout excès enrobera le reste de la cheville pendant le durcissement.
   4. Une fois durci, répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.3. jusqu’à ce que les chevilles aient été enduites trois fois de PDMS. Assurez-vous que la première couche de revêtement est complètement durcie avant de passer à la deuxième étape de revêtement.
      NOTE: Les revêtements finaux des chevilles doivent avoir une épaisseur de <2 mm sans imperfections visibles. Si le silicone reste collant après une nuit d’incubation à RT, laissez-le durcir pendant 24 h et jetez les revêtements si les chevilles sont encore collantes au toucher.
   5. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez autour de la base des chevilles recouvertes de silicone (aussi près que possible du bas) pour retirer les chevilles de la configuration du revêtement.
      NOTE: Ce processus doit être répété jusqu’à ce que le nombre souhaité de piquets et de tapis en silicone soit préparé. L’excès de PDMS utilisé dans le processus de revêtement des chevilles peut être utilisé pour couler de nouveaux tapis en silicone avant le durcissement.
3. Configuration du modèle
   1. Insérez les chevilles enduites dans le tapis en silicone et fixez le tapis dans le couvercle de la cheville, comme illustré à la Figure 1.
   2. Couvrez le dessous du couvercle de la cheville/tapis en silicone (fixé à la base de la cheville) avec du ruban adhésif autoclavable pour maintenir les chevilles en place. Placez la configuration du couvercle de la cheville dans un sac autoclavable scellé et stérilisez à l’autoclave avant utilisation.
      NOTE: Les chevilles dans le couvercle de la cheville s’insèrent dans une plaque de 96 puits dans une orientation singulière. Après avoir collé la configuration des chevilles, vérifiez l’alignement des chevilles dans une plaque de rechange à 96 puits et étiquetez le ruban autoclave en conséquence avec l’orientation correcte du couvercle.

3. Inoculation des modèles

1. Préparation de la culture bactérienne
   1. Préparez des cultures de nuit d’isolats bactériens à l’essai en suspendant une boucle de colonies bactériennes cultivées sur un milieu solide dans 10 ml de bouillon Luria-Bertani (LB). Incuber toute la nuit (18 h) à 37 °C en agitant.
      NOTE: Il est recommandé d’utiliser un minimum de trois réplicats biologiques dans le modèle de biofilm Flexipeg.
   2. Normaliser les cultures à une DO_{de 600 nm}de 0,1 (environ 10^{à 8} unités formant colonies (UFC)/mL après dilution sur plaque) dans un volume final de 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Installation et inoculation des microplaques
   1. Aliquote 135 μL d’urine humaine mélangée (UPH) dans chaque puits d’essai dans une plaque de 96 puits, conformément à la disposition des plaques de la figure 1 (8). Chaque puits représente une répétition technique (un minimum de n = 3 répétitions techniques sont nécessaires par répétition biologique).
      NOTE: Un milieu d’urine artificielle (AUM) peut être utilisé à la place du PHU si l’utilisateur le souhaite.
   2. Inoculer chaque puits d’essai avec 15 μL de la culture de nuit normalisée, ce qui donne un volume final de puits de 150 μL. Réserver au moins 100 μL de culture de nuit normalisée pour les dilutions en série afin de valider l’UFC/mL de l’inoculum.
   3. Préparer des témoins négatifs en aliquotent 150 μL de PHU stérile uniquement dans les puits appropriés.
   4. Après la configuration de la microplaque, insérez les chevilles dans leurs puits respectifs (tel que déterminé avant la stérilisation des chevilles en autoclave) et assurez-vous que le couvercle de la cheville affleure la surface de la plaque. Couvrez le couvercle de la cheville avec le couvercle de la microplaque, en le maintenant en place avec du ruban adhésif autoclave si nécessaire.
   5. Placez les modèles à chevilles dans un bac/sac en plastique scellé avec un rouleau bleu humide pour éviter l’évaporation, et incubez statiquement pendant 24 h à 37 °C.
3. Validation de l’inoculum
   1. Aliquote 180 μL de PBS dans les rangées 2 à 6 de la première colonne d’une microplaque de 96 puits et ajouter les 100 μL réservés de culture nocturne normalisée dans le premier puits.
   2. Prélever 20 μL de la culture de nuit normalisée du premier puits et faire l’aliquote dans le deuxième puits, en pipetant doucement de haut en bas pour mélanger.
   3. Répéter l’étape 3.3.2 jusqu’à ce que l’inoculum initial ait été dilué dans le puits final (1 × 10⁵).
   4. Déposer en trois exemplaires une quantité de 10 μL de chaque dilution sur un milieu solide approprié. Incuber statiquement toute la nuit à 37 °C.
   5. Après l’incubation, comptez le nombre de colonies à chaque endroit pour calculer l’UFC/mL réelle de l’inoculum.

4. Quantification du biofilm

1. Traitement des chevilles
   1. Après l’incubation, retirez le modèle à chevilles de la microplaque et retournez-le sous une flamme ou dans une enceinte de sécurité microbienne (chevilles vers le haut). Jeter les microplaques.
   2. Transférez le couvercle de la cheville dans une microplaque fraîche contenant 180 μL d’aliquotes de PBS stérile pour éliminer toutes les cellules non collées. Répétez deux fois dans le PBS frais pour un total de trois étapes de lavage.
      NOTE: Pour éviter d’endommager les biofilms associés à la surface, évitez de perturber les chevilles lorsque vous retirez le couvercle de la cheville de chaque microplaque (c.-à-d. en touchant les bords du puits).
2. Dénombrement UFC/mL (associé au biofilm)
   1. En travaillant de manière aseptique sous une flamme ou dans une enceinte de sécurité microbiologique, installez le support de tubes (fabriqué à l’étape 1.2.) avec des tubes à essai en verre stérile, comme illustré à la figure 1, et fixez le dessus du rack qui s’adapte au couvercle de la cheville.
   2. Aseptiquement, aliquote 600 μL de PBS stérile dans chaque tube à essai.
   3. Placez le couvercle de la cheville dans le panier, avec les chevilles alignées avec les tubes dans le panier. Retirez tout ruban adhésif d’autoclave sur le couvercle de la cheville.
   4. À l’aide d’une pince stérile, poussez les chevilles à travers le couvercle de la cheville et dans les tubes à essai correspondants alignés ci-dessous.
   5. Replacez les couvercles des tubes et agitez chaque tube pendant 60 s pour désagréger les cellules associées au biofilm de la surface de la cheville.
   6. Retirer 100 μL de chaque tube et diluer en série comme décrit précédemment à l’étape 3.3 dans du PBS stérile.
   7. À l’aide d’une pipette sérologique, plaquer 10 μL de chaque dilution sur un milieu solide approprié, et incuber statiquement à 37 °C pendant la nuit.
   8. Après l’incubation, comptez le nombre de colonies sur chaque plaque de dilution et utilisez-le pour calculer l’UFC/mL.
3. Coloration violette cristal
   1. Aliquote 180 μL de violet cristallin à 0,1 % (p/v) (dans de l’eau stérile) dans les 24 puits d’essai d’une microplaque de 96 puits.
   2. Insérez le modèle de cheville rincée (chevilles et couvercle de cheville) dans les puits correspondants de la microplaque. Incuber statiquement à température ambiante pendant 20 min.
   3. Après l’incubation, retirez le modèle à cheville de la microplaque et jetez la microplaque.
   4. Dans une baignoire de taille appropriée, rincez l’ensemble de la cheville installée à l’eau du robinet tout en agitant doucement. Répétez l’opération trois fois.
   5. Inversez le modèle de cheville et laissez les chevilles sécher complètement à RT.
   6. Aliquote 180 μL d’acide acétique à 30 % dans une microplaque fraîche à 96 puits et insérer le modèle de cheville séché dans les puits correspondants. Incuber à RT pendant 30 min.
   7. Retirez le modèle de cheville de la microplaque et lisez la DO_{540 nm} des puits colorés à l’aide d’un lecteur de microplaques ou d’un spectrophotomètre.
   8. Pour calculer la formation de biofilm sur les piquets, calculez la moyenne de_{la DO de 540 nm} des piquets de contrôle négatifs colorés et soustrayez-la de la moyenne des piquets lors du test.

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique de la configuration du modèle Flexipeg. (1) Un seul Flexipeg, enrobé de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour reproduire la surface du cathéter urinaire pour la formation d’un biofilm. (2) Le dispositif de bi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microplaques à 96 puits	Greiner	650161	Fond rond en forme de U.
Acide acétique	SLS	Référence 695092-2.5LSIG	≥ réactif ACS à 99,7 %.
Violet cristal	Merck	Référence 61135-25G
Cheville individuelle	À l’interne	Composants Flexipeg à imprimer en 3D	Fabrication additive à l’aide d’une résine stable à haute température (24 chevilles nécessaires par modèle Flexipeg). Fabriqué à l’aide de la résine haute température Formlabs de Protolabs (NL).
Bouillon Luria-Bertani (LB)	Néogène	NCM0088B	Bouillon LB (Miller).
Couvercle qui s’adapte à une plaque de 96 puits	À l’interne	Composants Flexipeg à imprimer en 3D	Fabrication additive à l’aide de résine stable à haute température.
Moule pour préparer un tapis en silicone	À l’interne	Composants Flexipeg à imprimer en 3D	Fabrication additive à partir de n’importe quel matériau durable. Fabriqué à l’aide de la résine de prototypage ABS par Protolabs (NL).
Moule pour préparer le côté du tapis en silicone	À l’interne	Composants Flexipeg à imprimer en 3D	Fabrication additive à partir de n’importe quel matériau durable.
Saline tamponnée au phosphate	Merck	P4417-50TAB
Accumulation d’urine humaine	-	-	Recueilli auprès de donneurs sains après approbation éthique par le comité d’éthique de la recherche de l’université centrale.
Rack pour tubes en verre	À l’interne	Composants Flexipeg à imprimer en 3D	Fabrication additive à partir de n’importe quel matériau durable.
Silicone (PDMS)	MB Fibre de verre	GP3481-F	Polycraft à usage général rtv condensation durcissement moule fabrication de caoutchouc de silicone.
Dessus qui s’adapte au couvercle de la cheville	À l’interne	Composants Flexipeg à imprimer en 3D	Fabrication additive à l’aide de résine stable à haute température.
Cathéters de Foley	Great Bear Healthcare Royaume-Uni Ltd		14 ch, 100 % silicone