Purification de vecteurs adénoviraux contenant le génome par gradient de chlorure de césium

Résumé

Source : Ehrke-Schulz, E., et al. Clonage et production à grande échelle de vecteurs adénoviraux à haute capacité basés sur l'adénovirus humain de type 5. J. Vis. Exp. (2016)

Ce vidéo montre la purification de vecteurs adénoviraux à haute capacité par ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium, permettant la séparation des virions contenant le génome pour des applications en transfert génique, en caractérisation des vecteurs et en études thérapeutiques précliniques

Protocole

1. Purification et dialyse des HCAdV (vecteurs adénoviraux à haute capacité)
   1. Pour préparer le lysat viral destiné aux gradients de chlorure de césium (CsCl), congeler la suspension cellules-virus dans l'azote liquide et décongeler au bain-marie à 37 °C 4x.
   2. Centrifuger le lysat viral à 500 x g pendant 8 min à température ambiante (TA) et récupérer le surnageant contenant les HCAdV (vecteurs adénoviraux à haute capacité).
   3. Pour l'ultracentrifugation, préparer les solutions de CsCl comme suit. Peser 37,5 g (pour 1,5 g/cm³)³), 33,5 g (pour 1,35 g/cm³³) et 31,25 g (pour 1,25 g/cm³)³) de poudre de CsCl, respectivement, et compléter avec de l'eau désionisée₂0 à 25 ml.
      1. Agiter jusqu'à ce que la solution devienne limpide, puis filtrer stérilement les solutions. Enfin, prélever 1 ml de chaque solution et le peser sur une balance de précision afin de vérifier si la densité est correcte. 1 ml doit peser respectivement 1,5 g, 1,35 g et 1,25 g.
      2. Si la densité est trop élevée, l'ajuster par ajout progressif de petits volumes (µl) de dH stérile₂O. Après l'ajout de dH₂O mesurer à nouveau la densité. Si nécessaire, ajouter plus de dH₂O₂O.
      3. Répétez la procédure jusqu'à ce que la densité soit correcte. Si la densité est trop faible, ajustez-la en ajoutant une petite quantité de poudre de CsCl. Filtrez de nouveau stérilement et vérifiez la densité. Si la densité est trop élevée, ajustez-la en ajoutant de l'eau désionisée (dH₂O).₂O comme décrit précédemment. Si la densité est encore trop faible, ajouter davantage de CsCl, filtrer stérilement à nouveau et vérifier la densité. Répéter la procédure jusqu'à ce que la densité soit correcte.
   4. Préparer des gradients en pas de CsCl dans 6 tubes à ultracentrifugation transparents. Introduire soigneusement et lentement les solutions de CsCl dans les tubes selon l'ordre suivant : 0,5 ml de 1,5 g/cm³,³ solution de CsCl, 3 ml de 1,35 g/cm³³ solution de CsCl, et 3,5 ml de 1,25 g/cm³³ Solution de CsCl (Figure 1C).
   5. Recouvrir ~4,5 ml de surnageant de vecteur clarifié de l'étape 1.2 sur le dessus du gradient de 1,25 g/cm³ de chlorure de césium.³ Couche de CsCl. Centrifuger les gradients dans une ultracentrifugeuse en utilisant un rotor à balancier (SW-41) à 12 °C pendant au moins 2 h à 226 000 x g (35 000 tr/min) avec une accélération et une décélération lentes, afin de séparer les particules virales contenant le génome d'HCAdV des particules vides et des débris cellulaires.
      REMARQUE : Dans des conditions optimales, une bande diffuse de débris cellulaires se forme au sommet des tubes. En dessous, deux bandes blanches peuvent être observées. La bande supérieure contient des particules vides, tandis que la bande inférieure correspond au HCAdVFigure 1C et 2A).
   6. Retirer soigneusement les couches de débris cellulaires et de particules vides, puis prélever 1 ml des bandes inférieures de chaque tube et transférer le virus à l’aide d’une pointe de pipette propre dans un tube stérile de 50 ml. Ajouter jusqu’à 24 ml de solution à 1,35 g/cm³³ Solution de CsCl aux particules virales recueillies et mélanger soigneusement.
   7. Remplir les tubes de centrifugation avec 1,35 g/cm³³ Ajouter la solution de virus au CsCl en haut de la colonne et centrifuger toute la nuit (18-20 h) à 226 000 x g (35 000 tr/min) à 12 °C dans une ultracentrifugeuse équipée d'un rotor à godets (SW-41) avec une accélération et une décélération lentes.
   8. Récupérez les HCAdV présents dans la bande inférieure marquée. Étant donné qu'une bande supérieure éventuelle contient des particules vides, retirez les couches supérieures à partir du sommet à l'aide d'une pipette (voir Figure 1C et 2B). Ensuite, prélevez la bande inférieure à l’aide d’une pipette.
   9. Dialyser les particules virales recueillies pour un échange de tampon.
      1. Couper une bande de tubulure dialysante (coupure moléculaire : 50 000) d'environ 8 cm de longueur, la laver avec du dH stérile₂O pendant 3 fois. Fermer ensuite un côté du tube de dialyse à l’aide d’une pince en plastique et transférer le virus recueilli à l’étape 5.8 dans le tube à l’aide d’une pipette de 1 ml. Éviter la formation de bulles d’air à l’intérieur du tube et le fermer à l’autre extrémité à l’aide d’une pince en plastique pour dialyse.
      2. Dialyser dans 1 L de tampon de dialyse (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 % de glycérol et 1 mM MgCl₂)₂ (chlorure de magnésium) dans du H désionisé₂O) pendant 2 h à 4 °C avec agitation lente. Changer le tampon de dialyse par 2 L de tampon de dialyse et dialyser toute la nuit à 4 °C avec agitation lente. En alternative, utiliser un tampon au saccharose (140 mM NaCl (chlorure de sodium), 5 mM Na₂HPO₄,2H₂O (phosphate monosodique de dihydrogène, 1,5 mM KH₂PO₄ (dihydrogénophosphate de potassium) et du saccharose à 730 mM, pH 7,8.
      3. Récupérer les particules virales dialysées de l'étape 1.9.2 à l'aide d'une pipette de 1 ml. Préparer plusieurs aliquotes de petits volumes souhaités (25-100 µl) et conserver le virus purifié à -80 °C.

Résultats

Figure 1. Résultats représentatifs de la procédure de clonage et de la libération du génome des HCAdV (vecteurs adénoviraux à haute capacité) à partir de pAdVFTC. (A) Libération de la cassette d'expression du gène d'intérêt (GOI) à partir de pHM5 par digestion avec PI-SceI et I-CeuI. (B) Cassette d'expression du GOI purifiée et pAdVFTC purifié et déphosphorylé, digéré respectivement avec PI-SceI et I-CeuI. (C) Digestion analytique par HincII de clones pAdVFTC avec et sans GOI. (D) Libération du génome HCAdV portant le GOI à partir de pAdVFTC-GOI par digestion avec NotI.

Figure 2. Résultats représentatifs après centrifugation en gradient de chlorure de césium (centrifugation en gradient de CsCl (A) Après avoir réalisé un gradient par paliers (voir également l'étape 1.5) ; (B) Après la centrifugation sur gradient continu (voir également l'étape 1.7).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube d'ultracentrifugation Ultra Clear	Beckmann Coulter	344059	centrifugation en gradient de densité
Ultracentrifugeuse	Beckmann Coulter		centrifugation en gradient de densité
Rotateur SW-41	Beckmann Coulter		centrifugation en gradient de densité
Mébrane Spectrapor Spectrum Laboratories	VWR	132129	tube de dialyse
Cassettes de dialyse prêtes à l'emploi	Thermo	66383	dialyse
Chlorure de césium	Carl Roth	8627.1	centrifugation en gradient de densité
Milieu LB	Carl Roth	X968.3	milieu de croissance bactérien
Tris-HCl 99 %	Carl Roth	9090.3	tampon de dialyse/tampon de lyse
Glycérol 99,5 %	Carl Roth	3783.1	tampon de dialyse
MgCl₂ 98,5 %	Carl Roth	KK36.2	tampon de dialyse
NaCl	Carl Roth	3957.1	tampon de dialyse facultatif
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	tampon de dialyse facultatif
Saccharose	Carl Roth	9286.1	tampon de dialyse facultatif
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	tampon de dialyse facultatif
Tubes de 1,5 ml	sarstedt	72,730,005	stockage des préparations virales à -80 °C