Confirmation de la transduction virale dans le foie de rat recellularisé par marquage immunohistochimique

Résumé

Source : Hiller, T. et. al. Étude des vecteurs viraux dans un modèle hépatique tridimensionnel repeuplé avec la lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire humain HepG2. J. Vis. Exp. (2016)

Ce vidéo montre la coloration immunohistochimique permettant d'évaluer le transfert génique viral dans un modèle de foie de rat recellulisé. L'expression du gène rapporteur, confirmée par détection par anticorps et co-localisation avec la coloration nucléaire, indique une transduction virale réussie dans les cellules.

Protocole

1. Transduction du foie de rat recellulisé

1. Production à grande échelle de vecteurs viraux dérivés de virus adéno-associés (vecteur AAV)
   1. Produire, purifier et quantifier les vecteurs AAV :
      1. Produisez brièvement les vecteurs AAV dans des bouteilles à rouleau et purifiez-les par centrifugation sur gradient d’iodixanol. Éliminez l’iodixanol résiduel par filtration sur colonnes de filtration sur gel PD10. Déterminez la concentration du vecteur AAV par réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) en utilisant l’ADN génomique d’AAV comme étalon.
         REMARQUE : Le vecteur AAV2/6 pseudotypé auto-complémentaire utilisé dans la présente étude codait pour une protéine rapporteuse fluorescente verte émeraude, EmGFP, afin de démontrer l’efficacité de la transduction, ainsi qu’un cassette d’expression d’ARN en épingle à cheveux court (shRNA) destiné à l’extinction d’un gène exprimé de façon endogène (cyclophiline B humaine (hCycB), Figure 1). Assurez-vous de disposer d’une quantité suffisante de vecteurs scAAV pseudotypés de sérotype 6 (2,7 x 10¹³ génomes de vecteurs par modèle de foie).
2. Transduction du modèle de foie
   1. Ajustez la solution de vecteur AAV à une concentration finale de 2,7 x 10¹³ génomes de vecteurs dans 5 mL en ajoutant le volume approprié de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   2. Déconnectez le foie du circuit de milieu en retirant le tube de la canule. Connectez une seringue de 5 mL à la canule de la veine porte et injectez intégralement la solution de vecteur AAV (5 mL).
      REMARQUE : Éventuellement, ajoutez du rouge de phénol (5 µg/ml) pour suivre la distribution de la solution de vecteur AAV dans tout le foie.
   3. Incubez pendant 1 heure sans pompage. Augmentez progressivement le débit, en commençant par 1,25 ml/min pendant 10 min ; 2,5 ml/min pendant 20 min et 3,75 ml/min pendant 30 min. Cultivez le foie de rat recellularisé pendant 6 jours.

2. Évaluation du foie de rat recellulaire transduit

1. Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) et analyse immunohistochimique
   1. Prélevez des échantillons (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) sur chaque lobe hépatique à l’aide d’un scalpel.
   2. Incubez les échantillons dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % + saccharose à 4 % pendant 1,5 heure à 4 °C. (Attention : le PFA est toxique et cancérigène. Manipulez toujours le PFA sous hotte et portez des vêtements de protection adaptés.) Rincez trois fois avec du PBS (1 minute par étape de rinçage) puis incubez dans du saccharose à 8 % toute la nuit à 4 °C.
   3. Verser le milieu de congélation dans des moules plastiques pour cryogélation, puis placez les échantillons dans le milieu, sans bulles d’air. Ajoutez du milieu de congélation jusqu’à ce que l’échantillon soit entièrement recouvert. Conservez les échantillons inclus à -80 °C jusqu’à utilisation ultérieure.
   4. Préparez des cryosections (10 µm) à l’aide d’un cryotome. Évaluez la recellularisation par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Évaluez l’efficacité de transduction par coloration immunohistochimique du gène d’intérêt (ici : EmGFP).

Résultats

Figure 1. Schéma du vecteur AAV2/6 pseudotypé auto-complémentaire utilisé dans la présente étude. Le génome comprend les répétitions terminales inversées (ITR) de l'AAV2 et code pour EmGFP sous le contrôle du promoteur CMV, ainsi que pour un ARNsh sous le contrôle d'un promoteur U6.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tissu-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	600001
Moule cryogénique 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566
Incubateur	Fraunhofer	/