Génération de cellules à knockdown conditionnel à l'aide d'un système d'expression lentiviral d'shRNA sensible à la tétracycline

Résumé

Source : Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. Inhibition conditionnel de l'expression génique dans des lignées cellulaires cancéreuses pour étudier le recrutement de monocytes/macrophages vers le microenvironnement tumoral. J. Vis. Exp. (2017)

Ce vidéo montre la génération de lignées cellulaires cancéreuses à inhibition conditionnelle à l'aide d'un système d'ARNi en boucle courte (shRNA) lentiviral inductible par la tétracycline (Tet). Elle décrit les étapes de la transduction virale, de la sélection par antibiotique et de la silencing génique induit par la doxycycline.

Protocole

1. Génération de lignées cellulaires transduites de façon stable
   1. Ensemencer les cellules de cancer du côlon HCT116 et les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 à raison de 50 000 cellules/puits dans un milieu de culture DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (Pen/Strep) dans une plaque de 12 puits. Incuber à 37 °C et 5 % CO₂ jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 60 à 70 %.
   2. Laver les cellules avec du tampon salin tamponné au phosphate (PBS) et ajouter 1 mL de milieu contenant le virus aux cellules cancéreuses, puis incuber toute la nuit à 37 °C et 5 % CO₂. En tant que contrôle, ajouter 1 mL de milieu DMEM frais complété avec 10 % de FBS et 1 % de Pen/Strep à 2 puits contenant des cellules cancéreuses.
   3. Retirer soigneusement le milieu contenant le virus par aspiration. Laver les cellules avec du PBS et remplacer le milieu par du DMEM contenant 10 % (v/v) de FBS sans tétracycline (Tet-free) et 1 % de Pen/Strep.
   4. Après 72 h, laver les cellules avec du PBS et changer le milieu pour du DMEM contenant 10 % de FBS sans tétracycline, 1 % de Pen/Strep et 1 µg/mL de puromycine, afin de sélectionner les cellules transduites par le virus.
      1. En fonction de la lignée cellulaire utilisée, ajuster la concentration de puromycine pour une sélection optimale en testant une gamme de concentrations (0,1, 0,5, 1, 2 et 5 µg/mL) sur des cellules non transduites, puis en choisissant la concentration la plus faible à laquelle aucune cellule témoin ne survit après 3 jours de culture.
   5. Sélectionner les cellules transduites par le virus en cultivant les cellules en présence de puromycine pendant 3 à 14 jours. En tant que contrôles, préparer deux puits supplémentaires avec des cellules non transduites, l'un avec un milieu contenant de la puromycine et l'autre sans puromycine. Observer une mort partielle des cellules induite par la puromycine dans le puits contenant les cellules transduites par le virus, par comparaison aux puits témoins.
      REMARQUE : Les cellules non transduites ne se développeront pas en présence de puromycine.
   6. Vérifier l'efficacité de l'extinction conditionnelle (KD) dans les cellules de cancer du côlon HCT116 et de cancer du sein MDA-MB-231 résistantes à la puromycine.
      REMARQUE : La concentration efficace de doxycycline varie selon la lignée cellulaire utilisée et doit être titrée (généralement entre 100 ng/mL et 2 µg/mL).
      1. Déterminer la concentration de doxycycline qui n'est pas toxique pour les cellules tout en étant efficace pour réduire l'expression de la protéine d'intérêt. Dans ce protocole, une concentration de 1 µg/mL a été utilisée avec succès in vitro.
      2. Cultiver les cellules pendant 72 h en présence ou en absence de 0,1, 1 et 2 µg/mL de doxycycline. Vérifier le niveau d'expression de la protéine réprimée (ici, l'inhibiteur 1 de l'activateur du plasminogène (PAI-1)) dans les lysats cellulaires par analyse en Western blot. Comparer les cellules HCT116 et MDA-MB-231 exprimant conditionnellement un ARN court sous forme de boucle (shRNA) aux cellules de contrôle avec séquence brouillée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vecteur lentiviral Tet-pLKO-puro	Addgene	21915
FBS (sans tétracycline)	Omega Scientific	FB-15
Vecteur psPAX	Addgene	12260
Vecteur pMD2.G	Addgene	12259
Cellules HEK293	ATCC	CRL-1573
PBS	Corning	21-031-CV
Milieu de Dulbecco modifié (DMEM)	Corning	10-013-CV
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Corning	21-031-CV
4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Puromycine	Sigma-Aldrich	P9620
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-25g
Milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Corning	10-040-CV
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140122