Préparation d'une suspension enrichie en virus par centrifugation sur gradient de saccharose discontinu

Résumé

Source : Vijayraghavan, S. et Kantor, B. Un protocole pour la production de vecteurs lentiviraux dépourvus d'intégrase pour l'inactivation génique médiée par CRISPR/Cas9 dans des cellules en division. J. Vis. Exp., (2017)

Ce vidéo montre une méthode de deux étapes par ultracentrifugation utilisant des gradients et des coussins de saccharose pour purifier et concentrer les particules virales à partir du surnageant de culture cellulaire. La procédure permet une séparation fondée sur la densité de flottaison, autorisant la récupération de virus intacts, adaptés à des applications en aval.

Protocole

1. Concentration des particules virales par ultracentrifugation

REMARQUE : Nous utilisons une méthode de purification par double saccharose qui comprend deux étapes : une étape de gradient de saccharose et une étape de coussin de saccharose (Figure 1).

1. Charger les tubes coniques d'ultracentrifugation dans l'ordre suivant pour créer un gradient de saccharose : 0,5 mL de saccharose à 70 % (dissous dans du tampon phosphate-saline 1x [PBS]), 0,5 mL de saccharose à 60 % (dissous dans du DMEM), 1 mL de saccharose à 30 % (dissous dans le milieu de culture modifié de Dulbecco [DMEM]) et 2 mL de saccharose à 20 % (dissous dans du PBS 1x).
2. Ajouter soigneusement le surnageant contenant le virus au gradient. Étant donné que le volume total du surnageant provenant de quatre plaques de 15 cm est de 100 mL, utiliser six tubes d'ultracentrifugation par rotation pour traiter l'intégralité du volume du surnageant viral.
   1. Chaque tube d'ultracentrifugation utilisé pour cette étape a une capacité volumétrique maximale de 30 mL (y compris le volume de saccharose). Répartir le surnageant viral de manière égale entre les tubes, en laissant au moins 10 % d'espace libre pour éviter tout débordement.
   2. Ajuster le volume de culture à environ 20 - 22 mL par plaque lorsqu'on utilise plus de quatre plaques de 15 cm par expérience, afin que le volume final du surnageant viral collecté puisse être facilement réparti dans six tubes d'ultracentrifugation.
   3. Remplir les tubes d'ultracentrifugation au moins aux trois quarts de leur capacité totale, faute de quoi une rupture des tubes pourrait survenir pendant la centrifugation, entraînant une perte éventuelle d'échantillon et/ou des dommages matériels.
3. Équilibrer les tubes avec du PBS 1x et centrifuger les échantillons à 70 000 x g pendant 2 h à 17 °C
   REMARQUE : Pour éviter la perturbation de la couche de saccharose pendant l'accélération, régler l'ultracentrifugeuse pour accélérer lentement le rotor jusqu'à 200 tr/min durant les 3 premières minutes de la rotation. De même, régler l'ultracentrifugeuse pour ralentir lentement le rotor de 200 tr/min à 0 tr/min sur une durée de 3 minutes à la fin de la rotation.
4. Collecter soigneusement les fractions de saccharose à 30 - 60 % dans des tubes propres (Figure 1). Ajouter du PBS 1x froid aux fractions regroupées et porter le volume à 100 mL ; mélanger en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas.
5. Passer à l'étape du coussin de saccharose en superposant délicatement la préparation virale sur un coussin de saccharose. Pour cela, ajouter 4 mL de saccharose à 20 % (dans du PBS 1x) dans le tube, puis environ 20 - 25 mL de la solution virale par tube. Si les tubes sont remplis à moins des trois quarts, compléter avec du PBS 1x stérile.
6. Équilibrer soigneusement et centrifuger les échantillons à 70 000 x g pendant 2 h à 17 °C, comme précédemment. Verser le surnageant et laisser le liquide résiduel s'écouler en retournant les tubes sur des essuie-tout.
7. Aspirer les gouttelettes restantes afin d'éliminer tout liquide du culot. À cette étape, les culots contenant le virus doivent être à peine visibles, apparaissant comme de petites taches translucides.
8. Resuspendre les culots en ajoutant 70 µL de PBS 1x dans le premier tube et en pipetant soigneusement la suspension, puis transférer la suspension dans le tube suivant et mélanger comme précédemment, en continuant jusqu'à ce que tous les culots soient resuspendus.
9. Rincer les tubes avec 50 µL supplémentaires de PBS 1x froid et mélanger comme auparavant. S'assurer que le volume total de la suspension finale est d'environ 120 µL et qu'elle présente une légère opalescence ; clarifier par centrifugation à 10 000 x g pendant 30 s sur une microcentrifugeuse de table.
10. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge, préparer des aliquotes de 10 µL et les conserver à -80 °C.
    REMARQUE : Éviter d'effectuer plusieurs cycles de congélation-décongélation sur les échantillons de lentivirus. Sauf lorsque la centrifugation est nécessaire, il convient d'effectuer les étapes restantes sous hotte de culture tissulaire ou dans des salles dédiées à la culture cellulaire, en respectant les mesures appropriées de biosécurité.

Résultats

Figure 1 : Concentration des particules virales à l'aide du protocole de gradient double au saccharose. Les particules virales recueillies à partir du surnageant (SN) sont chargées sur un gradient de saccharose. Des solutions de saccharose à 70 %, 60 %, 30 % et 20 % sont utilisées pour créer le gradient. Après centrifugation, les particules recueillies à partir des fractions de saccharose 30-60 % sont ensuite chargées sur un coussin de saccharose à 20 % et précipitées. Le culot final contenant les particules virales purifiées est remis en suspension dans du PBS 1x pour une utilisation ultérieure.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Équipement
Ultracentrifugeuse Optima XPN-80	Beckman Coulter	A99839
Centrifugeuse de table Allegra 25R	Beckman Coulter	369434
Tubes coniques pour ultracentrifugation	Seton Scientific	5067
Adaptateurs pour tubes coniques	Seton Scientific	PN 4230
Rotor à godets oscillants SW32Ti	Beckman Coulter	369650
Tubes coniques de centrifugation de 50 mL	Corning	430291
Pipettes pour culture cellulaire, 25 mL	Corning	4489