Évaluation du titre lentiviral par un test immuno-enzymatique (ELISA)

Résumé

Source : Vijayraghavan, S., et al. Protocole de production de vecteurs lentiviraux dépourvus d'intégrase pour l'inactivation génique par CRISPR/Cas9 dans des cellules en division. J. Vis. Exp. (2017).

Ce vidéo montre l'utilisation d'un ELISA p24 pour estimer les titres viraux de vecteurs lentiviraux. Le test consiste à lyser les particules virales afin de libérer la protéine p24, à la capturer à l'aide d'anticorps spécifiques, puis à la détecter à l'aide d'un système lié à la peroxydase produisant un changement de couleur mesurable. En comparant les valeurs d'absorbance des échantillons à une courbe étalon, le titre viral est quantifié.

Protocole

1. Estimation des titres viraux

1. Méthode de dosage immunoenzymatique (ELISA) de la protéine p24 (protéine de capside du virus de l'immunodéficience humaine (VIH)-1) - REMARQUE : Le dosage est réalisé à l’aide de plaques 96 puits à forte liaison, conformément aux instructions du programme NIH AIDS Vaccine Program pour le kit HIV-1 p24 Antigen Capture Assay (voir Tableau des Matériaux), avec des modifications.
   1. Le lendemain, laver les puits trois fois avec 200 µL de Tween 20 à 0,05 % dans du PBS froid (solution PBS-T). Recouvrir la plaque avec 100 µL d’anticorps monoclonal anti-p24 dilué à 1:1500 dans du PBS 1x et incuber toute la nuit à 4 °C.
   2. Pour éliminer les liaisons non spécifiques, bloquer la plaque avec 200 µL de BSA à 1 % dans du PBS ; laver trois fois avec 200 µL de Tween 20 à 0,05 % dans du PBS froid (solution PBS-T) pendant au moins 1 h à température ambiante.
   3. Préparer les échantillons : Pour les préparations vectorielles concentrées, diluer 1 µL de l’échantillon 100 fois en ajoutant 89 µL d’eau dd-H2O et 10 µL de Triton X-100 (concentration finale de 10 %). Pour les préparations non concentrées, préparer des échantillons dilués dix fois (ajouter 80 µL d’eau dd-H2O et 10 µL de Triton X-100 (concentration finale de 10 %) à 10 µL de l’échantillon). REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés à -20 °C à cette étape pendant une longue période pour une utilisation ultérieure.
   4. Préparer les étalons de VIH-1 par dilutions sérielles deux fois consécutives (avec une concentration initiale de 5 ng/mL).
   5. Diluer les échantillons concentrés (à partir de stocks préalablement dilués à 1:100) dans le milieu RPMI 1640 (milieu Roswell Park Memorial Institute 1640) complété avec 0,2 % de Tween 20 et 1 % de BSA pour obtenir des dilutions de 1:10 000, 1:50 000 et 1:250 000. Diluer les échantillons non concentrés (à partir de stocks préalablement dilués à 1:10) dans le milieu RPMI 1640 complété avec 0,2 % de Tween 20 et 1 % de BSA pour obtenir des dilutions de 1:500, 1:2500 et 1:12 500.
   6. Appliquer les échantillons sur la plaque en triplets et incuber toute la nuit à 4 °C.
   7. Le lendemain, laver les puits six fois et incuber à 37 °C pendant 4 h avec 100 µL d’anticorps polyclonal anti-p24 de lapin, dilué à 1:1000 dans du RPMI 1640 contenant 10 % de FBS, 0,25 % de BSA et 2 % de sérum de souris normal (NMS).
   8. Laver six fois comme indiqué ci-dessus et incuber à 37 °C pendant 1 h avec un anticorps IgG de chèvre anti-lapin couplé à la peroxydase, dilué à 1:10 000 dans du RPMI 1640 complété avec 5 % de sérum de chèvre normal, 2 % de NMS, 0,25 % de BSA et 0,01 % de Tween 20.
   9. Laver la plaque comme indiqué ci-dessus et incuber avec le substrat de peroxydase TMB (3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine) à température ambiante pendant 15 min.
   10. Arrêter la réaction en ajoutant 100 µL de HCl 1 N. Mesurer l’absorbance des échantillons à 450 nm à l’aide d’un lecteur de plaque à absorbance.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs pour ELISA p24
Anticorps monoclonal anti-p24	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
Étalon HIV-1	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Anticorps polyclonal de lapin anti-p24	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
Immunoglobuline G de chèvre anti-lapin liée à la peroxydase du raifort	Sigma Aldrich	12-348	Concentration de travail 1:1500
Sérum de souris normal, stérile, 500 mL	Equitech-Bio	SM30-0500
Sérum de chèvre, stérile, 10 mL	Sigma	G9023	Concentration de travail 1:1000
Substrat peroxydase TMB	KPL	5120-0076	Concentration de travail 1:10 000