Production de virus adéno-associés recombinants par transfection de plasmides

Résumé

Source : Ding, J., et al. Préparation du rAAV9 pour surexprimer ou inhiber des gènes dans les cœurs de souris. J. Vis. Exp. (2016)

Ce vidéo montre la production de particules de virus adéno-associé recombinant par transfection de plasmide dans des cellules de mammifères. Elle met en évidence l'expression coordonnée des protéines Rep, Cap et auxiliaires qui induisent la réplication du génome viral et l'assemblage de la capside au sein du noyau.

Protocole

1. Transfection de cellules HEK293 avec des plasmides du virus adéno-associé recombinant 9 (rAAV9)

1. Préparer une solution de polyéthylènimine (PEI) linéaire à 1 µg/µl. Dissoudre la poudre de PEI dans de l’eau désionisée sans endotoxine (dH₂O) préalablement chauffée à 70-80 °C. Après refroidissement à température ambiante (TA), neutraliser la solution à pH 7,0 à l’aide de HCl 1 M. Stériliser la solution par filtration (0,22 µm). Répartir la solution mère de PEI à 1 µg/µl en aliquots (1 400 µl/tube) et conserver la solution à -20 °C.
2. Cultiver les cellules HEK293 dans un milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 ± 0,5 % de dioxyde de carbone (CO₂).
3. Au jour 0, ensemencer les cellules HEK293 dans dix boîtes de 150 mm, 18 à 20 heures avant la transfection, en divisant les cellules ayant atteint une confluence > 90 % selon un facteur de dilution de 1:2.
   REMARQUE : Au jour 1, les cellules doivent atteindre une confluence de 90 %.
4. Au jour 1, transfecter les cellules HEK293 avec le plasmide rAAV9 (par exemple, les constructions rAAV9.cTNT::GFP ou rAAV6.U6::shRNA), le plasmide Ad-Helper et le plasmide AAV-Rep/Cap, en utilisant le PEI.
   1. Pour dix boîtes de cellules ayant atteint une confluence de 90 %, mélanger 70 µg du plasmide AAV-Rep/Cap, 70 µg du plasmide rAAV9 et 200 µg du plasmide Ad-Helper dans un tube centrifuge de 50 ml.
   2. Si la confluence est inférieure, ajuster proportionnellement la quantité d’ADN. Par exemple, si la confluence est de 75 %, réduire proportionnellement la quantité d’ADN (75/90 de la quantité indiquée à l’étape 1.4.1) : mélanger 70 x 75/90 = 58,3 µg du plasmide AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58,3 µg du plasmide rAAV9 et 200 x 75/90 = 166,7 µg du plasmide Ad-Helper dans un tube centrifuge de 50 ml.
   3. Ajouter 49 ml de DMEM à température ambiante (sans FBS) dans le tube de 50 ml et bien mélanger.
   4. Ajouter 1 360 µl de solution de PEI afin d’obtenir un rapport PEI:ADN (v/p) de 4:1. Bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 15 à 30 minutes.
   5. Ajouter 5 ml du mélange préparé à l’étape 1.4.4 dans chaque boîte de 150 mm (50 ml de mélange pour dix boîtes de 150 mm).
5. Cultiver les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 ± 0,5 % de CO₂ pendant 60 à 72 heures.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polymère de polyéthylèneimine linéaire (masse moléculaire 25 000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Tubes en polypropylène, 36,2 ml, 25 x 87 mm (quantité 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Milieu DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Sérum de veau fœtal	Atlanta Biologicals	S11150
Vecteur rAAV9	Penn Vector Core	P1967