Purification de particules virales recombinantes à partir de cellules rénales humaines transfectées

Résumé

Source : Ding, J. et. al., Préparation du rAAV9 pour surexprimer ou inhiber des gènes dans les cœurs de souris. J. Vis. Exp. (2016)

Ce vidéo montre la purification de particules virales recombinantes à partir de cellules rénales humaines transfectées. Le virus est libéré par lyse par cycles de congélation-décongélation et purifié à l'aide de gradients d'iodixanol avec filtration assistée par copolymère à blocs.

Protocole

1. Transfection de cellules HEK293 avec des plasmides viraux adéno-associés recombinants de sérotype 9 (AAV9r)
   1. Préparer 1 µg/µl de solution de polyéthylènimine (PEI) linéaire. Dissoudre la poudre de PEI dans de l'eau désionisée sans endotoxines₂O chauffé à 70-80 °C. Après refroidissement à température ambiante (TA), neutraliser la solution à pH 7,0 à l'aide d'acide chlorhydrique (HCl) 1 M. Stériliser par filtration (0.22 µm) la solution. Répartir en aliquotes 1 µg/µl Solution mère de PEI (1,400 µl/tube) et conserver la solution à -20 °C.
   2. Cultiver les cellules HEK293 dans un milieu de Dulbecco modifié (DMEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SBF) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Cultiver les cellules dans un 37 °C incubateur avec 5 ± 0,5 % de dioxyde de carbone (CO₂)₂).
   3. Au jour 0, ensemencer des cellules HEK293 dans dix boîtes de 150 mm, 18 à 20 heures avant la transfection, par fractionnement > Cellules à 90 % de confluence en dilution 1:2.
      REMARQUE : Au jour 1, les cellules doivent atteindre une confluence de 90 %.
   4. Au jour 1, transfecter les cellules HEK293 avec le plasmide rAAV9 (par exemple, les constructions rAAV9.cTNT::GFP ou rAAV6.U6::shRNA), le plasmide Ad-Helper et le plasmide AAV-Rep/Cap à l'aide de PEI.
      1. Pour 10 boîtes de cellules à 90 % de confluence, mélanger 70 µg du plasmide AAV-Rep/Cap, 70 µg plasmide pfrAAV9, et 200 µg du plasmide auxiliaire Ad dans un tube à centrifuger de 50 ml.
      2. Si les cellules sont moins confluentes, ajuster la quantité d'ADN proportionnellement. Par exemple, si les cellules présentent une confluence de 75 %, réduire la quantité d'ADN proportionnellement (75/90 de la quantité indiquée à l'étape 2.4.1) : mélanger 70 × 75/90 = 58.3 µg du plasmide AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58.3 µg de plasmide rAAV9, et 200 × 75/90 = 166.7 µg du plasmide Ad-Helper dans un tube à centrifuger de 50 ml.
      3. Ajouter 49 ml de DMEM à température ambiante (sans FBS) dans le tube de 50 ml et mélanger soigneusement.
      4. Ajouter 1,360 µl du solution de PEI pour obtenir un rapport PEI : ADN (v/p) de 4:1. Bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 15 à 30 min.
      5. Ajouter 5 ml du mélange préparé à l'étape 1.4.4 dans chaque plaque de 150 mm (50 ml de mélange pour dix plaques de 150 mm).
   5. Cultiver les cellules dans un 37 °C incubateur avec 5 ±0,5 % CO₂ pendant 60 à 72 heures.
2. Récolte des cellules HEK293 transfectées et purification des vecteurs rAAV9
   1. Récolter les cellules 60 à 72 heures après la transfection. Détacher et suspendre les cellules dans les boîtes en les aspirant et recrachant plusieurs fois avec le milieu de culture. Transférer toutes les suspensions cellulaires dans des tubes stériles de 50 ml.
   2. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min. Resuspendre le culot cellulaire avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans chaque tube et rassembler toutes les suspensions cellulaires dans un même tube de 50 ml.
   3. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant. À cette étape, conserver le culot cellulaire à -80 °C ou purifier immédiatement l'AAV à partir du culot, comme décrit aux étapes 2.4 à 2.15.
   4. Préparer le tampon de lyse : 150 mM de chlorure de sodium (NaCl) et 20 mM de Tris(hydroxyméthyl)aminométhane chlorhydrate (Tris-HCl, pH 8,0). Stériliser par filtration (0.22 µM). Conserver le tampon à 4 °C.
   5. Resuspendre le culot avec 10 ml de tampon de lyse.
   6. Congeler le lysat à -80 °C ou dans le bain de glace sèche/éthanol, puis le faire dégeler à 37 °CVortexer pendant 1 min. Congeler et décongeler le lysat trois fois.
   7. Ajouter du chlorure de magnésium (MgCl₂) à 10 mM.₂) solution au lysat décongelé (ajuster la concentration finale de MgCl₂ dans le lysat soit de 1 mM). Ajouter la nucléase à une concentration finale de 250 U/ml. Incuber à 37 °C pendant 15 min pour dissoudre l'agrégation ADN/protéine.
      REMARQUE : Si l'agrégat d'ADN/protéine n'est pas dissous après le traitement par nucléase ou endonucléase, homogénéiser les lysats au mortier Dounce 20 fois.
   8. Centrifuger l'échantillon à 4 800 x g pendant 20 min à 4 °C. Recueillir le surnageant.
   9. Pendant ce temps, préparez la solution de gradient d’iodixanol :
      1. Préparer la solution à 17 % du gradient en mélangeant 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de MgCl₂ 1 M,₂, 0,125 ml de chlorure de potassium (KCl) 1 M, 10 ml de NaCl 5 M et 12,5 ml de milieu de gradient de densité. Ajuster le volume total à 50 ml à l'aide de H₂O.
      2. Préparer la solution à 25 % en mélangeant 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de MgCl₂ 1 M₂, 0,125 ml de KCl 1 M, 20 ml de milieu de gradient de densité et 0,2 ml de rouge de phénol 0,5 % (p/v). Ajuster le volume total à 50 ml à l'aide de H₂O.
      3. Préparer la solution à 40 % en mélangeant 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de MgCl 1 M₂, 0,125 ml de KCl 1 M et 33,3 ml de milieu pour gradient de densité. Ajuster le volume total à 50 ml à l'aide de H₂O.
      4. Préparer la solution à 60 % en mélangeant 0,05 ml de MgCl 1 M₂, 0,125 ml de KCl 1 M, 50 ml de milieu de gradient de densité et 0,1 ml de Rouge de Phénol 0,5 % (p/v).
   10. Avec une seringue et une aiguille, charger la solution de gradient d'iodixanol dans un tube en polypropylène selon l'ordre suivant, en commençant par le fond : 5 ml de 17 %, 5 ml de 25 %, 5 ml de 40 % et 5 ml de 60 %. Déposer l'intégralité du lysat obtenu à l'étape 3.8 (14 à 16 ml) au-dessus du gradient. Le gradient, énuméré du bas vers le haut, est composé de 60 %, 40 %, 25 %, 17 %, puis de la couche de lysat. Remplir le tube avec du tampon de lyse et le recouvrir d'un bouchon.
   11. Centrifuger à 185 000 x g pendant 90 min à 16 °C.
   12. Prélèver la fraction virale (couche à 40 %) à l’aide d’une seringue. Insérer l’aiguille (21 gauge) au niveau de l’intersection entre les couches à 40 % et 60 %, en aspirant uniquement la couche à 40 %.
       REMARQUE : Éviter d'aspirer la couche à 25 %.
   13. Mélanger la fraction virale avec une solution stérile de copolymère bloc polyoxyéthylène-polyoxypropylène dans du PBS (solution mère de copolymère bloc polyoxyéthylène-polyoxypropylène à 10 % diluée 1:10 000 dans du PBS) jusqu'à un volume total de 15 ml. Charger le mélange dans le tube de filtration (coupure moléculaire = 100 kD). Centrifuger à 2 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
   14. Éliminer la solution du fond. Remplir à nouveau le tube filtrant avec une solution de PBS contenant du copolymère bloc polyoxyéthylène-polyoxypropylène jusqu'à un volume total de 15 ml. Centrifuger à 2 000 x g pendant 20 min à 4 °CRépétez cette étape deux fois supplémentaires. Récupérez le virus rAAV9 purifié (la fraction située au-dessus du filtre).
   15. Transférer le rAAV9 purifié contenu dans le tube de filtration vers des tubes de 1,7 mL. Aliquoter le rAAV9 purifié (100 - 400 µl/tube, selon le volume et le titre de l'AAV) et conserver le virus à -80 °C.
       REMARQUE : Éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polymère d'éthylèneimine linéaire (PM 25 000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Tubes en polypropylène, 36,2 ml, 25 x 87 mm (qté 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Nucléase, ultrapure	SIGMA	#E8263-25KU
Milieu de gradient de densité (iodixanol)	SIGMA	#D1556-250ML
Unité de filtration centrifuge avec membrane Ultracel-100	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
Aiguille de pipetage de laboratoire avec extrémités émoussées à 90°, calibre 14, longueur 6 po, embase plaquée au nickel	SIGMA	#CAD7942-12EA
Solution de Poloxamer 188 (solution Pluronic® F-68)	SIGMA	P5556-100ML
Protéinase K	SIGMA	3115828001
DNase I	Roche	10104159001
Centrifugeuse	Thermo Scientific	75004260
Système de centrifugation	Beckman Coulter	363118
Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter
Milieu DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Sérum de veau fœtal	Atlanta Biologicals	S11150
Vecteur rAAV9	Penn Vector Core	P1967