Immortalisation de cellules endothéliales par transduction rétrovirale d'oncogènes viraux

Résumé

Source : McAllister, S. C., Hanson, R. S., et al. Un modèle in vitro pour l'étude de la transformation cellulaire par le virus d'herpès du sarcome de Kaposi. J. Vis. Exp.(2017)

Ce vidéo montre la transduction rétrovirale de cellules endothéliales primaires avec les oncogènes HPV16 E6/E7. Les oncogènes intégrés inactivent les suppresseurs tumoraux p53 et Rb, prolongeant ainsi la durée de vie des cellules. La sélection par la G418 enrichit les cellules transduites, produisant des cultures endothéliales immortalisées adaptées aux études de transformation.

Protocole

Transduction de cellules endothéliales (CE) avec les gènes viraux du papillomavirus E6 et E7

REMARQUE : Nous utilisons habituellement des flacons de culture tissulaire standard pour la culture des CE primaires. Toutefois, si la croissance des CE est insatisfaisante, l'utilisation de flacons de culture commerciaux devrait être envisagée.

1. Cultiver les cellules endothéliales primaires humaines microvasculaires dermiques ou lymphatiques dans un incubateur humidifié à 37 °C plus 5 % CO₂₂ dans un milieu de croissance pour cellules endothéliales (EGM ; contenant un milieu basal pour cellules endothéliales [EBM] complété par le kit EGM-2 BulletKit [comprenant du sérum de veau fœtal, de l'hydrocortisone, du facteur de croissance fibroblastique humain-B, du facteur de croissance endothélial vasculaire, du facteur de croissance insulinomimétique-1, de l'acide ascorbique, du facteur de croissance épithélial humain, des antibiotiques et de l'héparine]) dans un flacon de culture cellulaire T75 jusqu'à une confluence d'environ 50 %.
2. Pour la transduction, cultiver les cellules PA317 LXSN 16E6E7 dans un incubateur humidifié à 37 °C plus 5 % CO₂₂ dans le milieu de culture Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) complété avec 10 % de sérum de veau fœtal et des antimicrobiens, dans un flacon de culture cellulaire T150 jusqu'à une confluence d'environ 90 %. Incuber ensuite toute une nuit dans 16 mL de milieu.
3. Clarifier le milieu PA317 par centrifugation à 300 × g × g pendant 5 min à température ambiante.
4. Retirer l'EGM de la culture des CE et recouvrir les cellules avec 12 mL du milieu PA317 clarifié, puis incuber pendant 4 h.
   REMARQUE : Centrifuger 16 mL de milieu conditionné à 300 × g × g pendant 5 min donne un culot compact qui n'est pas perturbé par le retrait soigneux ultérieur de 12 mL de surnageant clarifié. Toutefois, si le transfert de cellules PA317 LXSN 16E6E7 vers les cultures primaires de CE est une préoccupation (la lignée cellulaire d'emballage surpassera rapidement les CE), alors une filtration du surnageant conditionné à travers une membrane de 0,45 µm peut être réalisée. 0.45 µm filtrer avant le transfert peut être effectué.
5. Remplacer 6 mL du milieu PA317 par du milieu EGM frais et incuber toute la nuit.
6. Replacer le milieu des CE par 12 mL de milieu EGM frais et incuber pendant 48 h supplémentaires.
7. Pour la sous-culture des EC, retirer le milieu et laver avec 12 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans cations, puis ajouter 3 mL de solution commerciale de dissociation enzymatique (par exemple, TrypLE) et incuber à 37 °C pendant 3 min.
8. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 300 × g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendre le culot cellulaire obtenu dans du milieu EGM frais et répartir uniformément dans 3 × flacons T75 avec un volume final de 12 mL de milieu EGM par flacon
9. Pour sélectionner les cellules endothéliales transduites avec E6 et E7, ajouter de la G418 à une concentration finale de 200 µg/mL pendant deux passages, après quoi les EC transduits peuvent être ensemencés pour infection ou congelés dans de l'azote liquide.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules BCBL-1	NIH AIDS Reagent Program	3233
Cellules PA317	ATCC	CRL-2203
Cellules endothéliales microvasculaires dermiques néonatales	Lonza	CC-2505
Milieu basal EBM-2	Lonza	CC-3156
Kit EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
RPMI
DMEM
PBS avec calcium et magnésium