Visualisation et évaluation de la taille du Faustovirus par microscopie électronique

Résumé

Source : Bou Khalil, J. Y., et al. Une stratégie rapide pour l'isolement de nouveaux Faustovirus à partir d'échantillons environnementaux en utilisant Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).

Ce vidéo montre l'imagerie de particules de faustovirus provenant d'une culture d'amibe infectée à l'aide de la microscopie électronique en transmission. Elle couvre la préparation de la grille, la coloration négative avec du molybdate d'ammonium pour améliorer le contraste, et la visualisation du virus au microscope. Le protocole se termine par la mesure de la taille du faustovirus à l'aide des outils logiciels intégrés du microscope.

Protocole

1. Microscopie électronique
   1. Après la première identification sur les lames, évaluer la présence du virus géant par observation en microscopie électronique des cultures de surnageant.
   2. Déposer 5 µl de l'échantillon positif sur une grille préalablement soumise à un traitement par décharge lumineuse. Attendre environ 20 minutes à température ambiante.
   3. Sécher délicatement la grille et y déposer une petite goutte de molybdate d'ammonium à 1 % pendant 10 secondes. Laisser sécher la grille pendant 5 minutes.
   4. Procéder à l'observation en microscopie électronique à 200 keV.
   5. Placer la grille sur le porte-objet, puis insérer celui-ci dans le microscope. Vérifier l'aperçu du vide en cliquant sur l'icône correspondante. Fermer les vannes et commencer l'observation avec une taille de spot de 5 et un grossissement de × 25 000.
   6. Mesurer le virus géant à l’aide du logiciel ImageJ ou directement sur le microscope en utilisant l’outil de mesure situé sur l’écran d’acquisition.
      REMARQUE : Classer l'échantillon dans le groupe des Faustovirus en fonction d'une taille de capsides d'environ 200 nm.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souche d'amibe CDC-19	ATCC	France	50237
Plaques	Cellstar	France	655180
Filtres à vide	Thermo scientific	France	BPV4550 / 20170115
Solution saline tamponnée au phosphate	Thermo Fisher scientific	France	10010-023
Colorant DAPI	Life Technologies	France	D1306
Grilles de carbone	Euromedex	France	FCF400NI
Molybdate d'ammonium	VWR internationanl	France	21276185
Flacons	SARSTEDT	Allemagne	833911
Filtres de 0,22 μm	Milex millipor	France	SE2M229104
Ultracentrifugeuse Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448
Filtres à débit rapide	Nalgene	France	450-0020