Détermination de la distribution de l'ARN viral dans les cellules hôtes par hybridation in situ en fluorescence

Résumé

Source : Vallery, T. K. & Steitz, J. A. Hybridation in situ en fluorescence quantitative (FISH) et immunofluorescence (IF) de produits géniques spécifiques dans des cellules infectées par le VHSK. J. Vis. Exp. (2019)

Ce vidéo montre l'hybridation in situ en fluorescence pour visualiser l'ARN viral dans des cellules infectées par un virus. Elle décrit les étapes impliquées dans l'hybridation de la sonde, l'amplification du signal et l'imagerie confocale.

Protocole

1. Fixation, hybridation et visualisation des ARN viraux

1. Retirer le milieu et les cellules excédentaires. Tout au long de ce protocole, utiliser une aspiration sous vide pour éliminer les solutions et une micropipette pour ajouter les solutions délicatement.
   REMARQUE : L'intensité du vide peut être réduite en plaçant une pointe de micropipette de 200 µL sur la pipette Pasteur en verre. Remplacer la pointe de micropipette entre chaque étape de lavage afin d'éviter toute contamination. Chaque étape de lavage doit être effectuée rapidement car il est impératif que les cellules ne s'assèchent jamais.
2. Fixer immédiatement les cellules avec du formaldéhyde 4 %/PBS (solution saline tamponnée au phosphate) prérefroidi sur de la glace pendant 30 min. Laver les cellules trois fois avec 200 µL de PBS 1x refroidi à 4 °C et incuber pendant 5 min à température ambiante ou sur de la glace.
   1. Perméabiliser les cellules fixées avec 200 µL de Triton-X 0,5 %/PBS prérefroidi pendant 10 min sur de la glace ou avec 750 µL d'éthanol 70 % prérefroidi à 4 °C pendant 1 h (min) à 7 j (max).
      REMARQUE : Tous les lavages de ce protocole sont réalisés de la même manière, sauf indication contraire. L'éthanol 70 % ramollit l'adhésif entre les chambres et la lame, facilitant ainsi leur séparation ultérieure, et permet également une pause significative dans le protocole. Néanmoins, utiliser un film de paraffine autour de la lame à chambres pour réduire l'évaporation et vérifier le niveau d'éthanol dans chaque chambre environ toutes les 8 h. L'éthanol 70 % aplanit également les cellules, produisant une image plus nette, tandis que le Triton-X n'entraîne pas de déshydratation cellulaire ni de modification des dimensions cellulaires.
3. Retirer soigneusement les chambres afin d'éviter de fissurer la lame.
   REMARQUE : Utiliser un dispositif de retrait neuf ou présentant très peu d'adhésif résiduel fourni par le fabricant, et retirer délicatement les chambres pour éviter que la lame ne se fissure. Utiliser l'éthanol 70 % comme réactif de perméabilisation pendant 4 h réduit considérablement le risque de fissuration. En cas de fissure, poursuivre le protocole sur les chambres non affectées par la fissure et être attentif au taux d'oxydation plus élevé des lames mal scellées (c'est-à-dire une durée de conservation réduite).
4. Laver les cellules une fois avec du SSC 2x (citrate de sodium et chlorure de sodium) puis appliquer 45 µL de solution d'hybridation composée de 50 % de formamide, 10 % de dextrane sulfate, SSC 2x, BSA (albumine sérique bovine) 0,1 %, ADN (acide désoxyribonucléique) de sperme de saumon à 500 µg/mL, ARN de transfert (ARNt) d'E. coli à 125 µg/mL et complexes ribonucléosidiques de vanadyle à 1 mM. Incuber pendant 1 h à 37 °C dans une chambre humide, par exemple une boîte de Pétri de 150 mm contenant des lingettes stériles humidifiées.
   REMARQUE : Préparer la solution d'hybridation fraîchement au moins une heure avant utilisation. Dissoudre d'abord le dextrane sulfate dans l'eau, en vortexant fréquemment et en incubant dans un bain-marie à 37 °C.
5. Calculer la quantité d'oligonucléotides nécessaire pour atteindre la concentration recommandée de 25 µM dans 35 µL de solution d'hybridation par chambre. Ajuster la concentration de l'oligonucléotide antisens selon les besoins. Ajouter de l'eau distillée aux oligonucléotides afin d'obtenir un volume de dénaturation de 10 µL.
   REMARQUE : Après la réaction de marquage, les oligonucléotides sont conservés dans une solution éteinte contenant 0,18 M de cacodylate de potassium, 23 mM de Tris-HCl, 0,23 mg/mL de BSA, 4,5 mM de CoCl₂, 18 mM d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA), 2,7 mM de phosphate de potassium, 6,8 mM de KCl, 45 µM de 2-mercaptoéthanol, 0,02 % de Triton X-100 et 2 % de glycérol. Les concentrations sont suffisamment élevées pour que la dilution avec de l'eau amène la solution de dénaturation à des concentrations proches de 1x TE (10 mM Tris-HCl et 1 mM EDTA), un tampon de dénaturation d'oligonucléotides standard.
6. Dénaturer les oligonucléotides marqués à la digoxigénine (DIG) et/ou à l’Alexa Fluor 594 à 95 °C pendant 5 min. Ajouter ensuite 35 µL de solution d'hybridation fraîche par chambre prévue aux oligonucléotides dénaturés. Si une double hybridation in situ en fluorescence (FISH) est réalisée, les deux jeux d'oligonucléotides antisens peuvent être dénaturés et hybridés ensemble.
7. Retirer la solution de pré-hybridation, puis ajouter la solution d'hybridation contenant les oligonucléotides marqués aux cellules. Incuber toute la nuit dans la chambre humide à 37 °C, en protégeant les oligonucléotides marqués par des fluorophores avec du papier d’aluminium.
   REMARQUE : L'incubation doit durer au moins 10 h et pas plus de 24 h.
8. Le lendemain, laver les cellules deux fois avec du SSC 2x pendant 10 min à 37 °C, puis deux fois avec du SSC 1x pendant 10 min à 25 °C.
9. Fixer les cellules avec du formaldéhyde 4 %/PBS 1x prérefroidi pendant 10-15 min sur de la glace. Laver ensuite les cellules trois fois avec du PBS et les perméabiliser pendant 1 h avec de l'éthanol 70 % prérefroidi ou pendant 10 min avec du Triton-X 0,5 %/PBS 1x prérefroidi à 4 °C.
10. Incuber les cellules avec un anticorps anti-digoxigénine (DIG)–isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dilué 1:200 dans du PBS 1x contenant 0,1 % de BSA prérefroidi pendant 1 h à 4 °C. Retirer la solution d'anticorps et laver trois fois avec du PBS 1x.
11. Fixer avec du formaldéhyde 4 %/PBS 1x prérefroidi pendant 10-15 min à 4 °C, puis laver trois fois avec du PBS 1x.
12. Incuber les cellules avec 0,4 µg/mL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans du PBS 1x contenant 0,5 % de Triton-X prérefroidi pendant 15 min sur de la glace, puis laver trois fois avec du PBS 1x.
13. Monter les lames avec des billes fluorescentes (facultatif) et un milieu de montage. Sceller ensuite la lame de couverture sur la lame avec du vernis à ongles transparent.
14. À l’aide d’un microscope confocal, acquérir des images des échantillons dans l’heure suivant la réalisation du protocole jusqu’à une semaine après, avec un grossissement de 630x. Appliquer plusieurs couches de vernis à ongles pour sceller la lame de couverture et prolonger la durée de vie des fluorophores en réduisant le taux d’oxydation.
    REMARQUE : Ne pas utiliser un milieu de montage contenant du DAPI. Lors de l’acquisition des images, inclure une barre d’échelle sur chaque image pour une quantification ultérieure. Les billes fluorescentes servent de témoins de l’intensité de fluorescence entre les lames et les préparations d’échantillons. Acquérir les images au niveau de la section médiane des cellules pour une quantification en deux dimensions (2D).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
Sulfate de dextrane	Sigma Aldrich	D8906	Qualité biologie moléculaire
Kit de marquage par oligonucléotides DIG	Sigma Roche	#03353583910	2e génération
Lames à huit chambres	Nunc Lab Tek II	#154453	Le joint bleu favorise la tension superficielle, mais une séparation par gel transparent est également disponible.
Formamide	Sigma Aldrich	F9037	Qualité biologie moléculaire
Complexes de ribonucléosides de vanadyle	NEB	S1402S