Mesure de l'induction spontanée des phages dans des bactéries lysogènes au cours du temps

Résumé

Source : Krishnamurthi, R., et al. Comprendre l'impact des bactériophages tempérés sur leurs lysogènes par transcriptomique. J. Vis. Exp. (2024).

Ce vidéo montre l'énumération temporelle de l'induction spontanée de phages chez Pseudomonas aeruginosa lysogène, en quantifiant les cellules bactériennes viables (UFC) et les particules de phages infectieux (UPF) au fil du temps. En prélevant des échantillons à intervalles réguliers pendant la croissance et en analysant la formation de colonies et de plaques, cette méthode permet de déterminer le moment où l'induction spontanée est minimale. Cela permet d'identifier les points temporels optimaux pour des analyses transcriptomiques ultérieures avec un minimum d'interférences lytiques.

Protocole

1. Énumération directe temporelle de l'induction spontanée (Figure 1)

1. Préparer des cultures initiales de 24 heures pour le lysogène (par exemple, le lysogène de P. aeruginosa PAO1 portant les phages LES (Liverpool Epidemic Strain (LES) bacteriophages)) et pour l'hôte indicateur (PAO1-RifR) en inoculant une colonie unique dans 5 mL de bouillon LB (Luria–Bertani), puis incuber à 37 °C sous agitation à 180 tr/min (18–24 h).^R) (résistant à la rifampicine Pseudomonas aeruginosa PAO1) en inoculant une colonie unique dans 5 mL de LB (bouillon de Luria-Bertani), et incuber à 37 °C avec agitation à 180 tr/min (18–24 h).
2. Préparer des cultures fraîches de lysogène et d'hôte indicateur en inoculant les cultures prélevées de la veille dans 100 mL de milieu LB à un ratio de 1:100, et incuber à 37 °C avec agitation (180 tr/min).
   1. Surveiller la croissance du lysogène en mesurant l'OD₆₀₀ et dénombrement des cellules viables selon la technique de Miles Misra. Pour ce faire, prélève un échantillon de 1 mL de chaque culture de lysogène toutes les heures, à partir du moment de l'inoculation, pendant 8 h.
   2. Diluez sériellement l'échantillon immédiatement après prélèvement en ajoutant 100 µL de l'échantillon dans 900 µL du milieu respectif. Vortexer soigneusement à vitesse maximale, jeter la pointe à chaque dilution et poursuivre la série de dilutions de 10⁻¹ à 10⁻⁹.⁻¹ à 10⁻⁹.
   3. Déposer 10 µL des dilutions requises en triple exemplaire sur une boîte de gélose LB, laisser sécher, puis incuber à 37 °C pendant 18 à 24 h.

   4. Pour calculer le nombre de cellules bactériennes viables, identifier une dilution présentant des colonies facilement dénombrables. Compter le nombre de colonies sur chaque spot, puis utiliser la formule suivante :
       

      

      
      REMARQUE : Au fur et à mesure que la culture de lysogène croît, des particules de phage actives sont produites par induction spontanée. La production de phages infectieux signifie que le transcriptome de la population lysogène est désormais contaminé par l'expression génique associée au cycle de réplication lytique, provenant du signal de réplication du phage lytique et de la réponse correspondante de la cellule hôte. Il est donc essentiel d'identifier la phase de croissance au cours de laquelle le rapport entre les cellules lysogènes et les particules phagiques infectieuses libres est maximal, afin de limiter au maximum le bruit de fond en transcription (généré par le transcriptome du phage lytique) dans le jeu de données.

3. Pour dénombrer les particules de phage infectieuses dans chaque échantillon temporel, inoculer 5 mL d'agar bactériologique stérile à 0,4 % dans du bouillon LB (agar supérieur) avec 100 µL d'hôte indicateur en phase exponentielle intermédiaire (OD600 : 0,4–0,5 ; dans ce cas, PAO1-Rif^Ren présence d'un agent sélectif approprié (50 µg·mL⁻¹ rifampicine dans ce cas, car la CMI de l'hôte PAO1 n'est que 16 µg·mL⁻¹)
   1. Déposer 10 µL de la même dilution au dixième (voir étape 1.2.2) sur la couche d'agar supérieur inoculée, et laisser sécher avant d'incuber à 37 °C pendant 18 à 24 h.

   2. Pour calculer le nombre de particules phagiques infectieuses, identifier une dilution présentant des plaques facilement dénombrables. Compter le nombre de plaques dans chaque spot.
       

      

   3. Déterminer le moment ou la condition pour lesquels l'induction spontanée par UFC (unité formant colonie) est minimale afin de poursuivre les étapes expérimentales.

Résultats

Figure 1 : Le schéma expérimental pour le dénombrement des PFU et des CFU d'un lysogène à partir d'un même échantillon.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
PAO1		6
LESB58		6
Phages LES	Induits et purifiés à partir de LESB58 à l'aide de la norfloxacine.
Bouillon Lysogène (LB)	Merck	1.10285.500
Agar LB	Merck	1.10283.500
Agar Agar	Fisher	A/1080/53
Agar supérieur	0,4 g d'Agar Agar + 2,5 g de bouillon LB dans 100 mL d'eau ; stériliser au autoclave et utiliser.	-
Rifampicine	Sigma (Solution mère : 50 mg/mL dans du méthanol — Bien mélanger, stériliser par filtration sur filtre de 0,22 µm et conserver à -20 °C jusqu'à utilisation)	R3501