Ce vidéo montre l'induction de la réplication lytique d'un prophage intégré dans le génome bactérien et la capture des changements d'expression génique par des prélèvements temporels destinés à une analyse transcriptomique.
Article de méthode
Induction de la réplication lytique du prophage pour l'analyse transcriptomique
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30 septembre 2026
Dans cet article
Résumé
Protocole
1 . Préparation de cultures de lysogènes non induites et induites pour l'extraction d'ARN (acide ribonucléique)
- Préparer une culture fraîche de nuit en inoculant une colonie unique du lysogène dans 5 mL de LB, puis incuber à 37 °C avec agitation (180 tr/min) pendant 18 à 24 h.
- Subcultiver la culture de nuit dans 80 mL de LB (bouillon de lysogénie) à un ratio de 1:100 dans huit flacons de 250 mL.
- Étiqueter le premier flacon comme « non induit » et les autres comme « induits », ainsi que les points temporels auxquels chaque échantillon doit être récolté (c’est-à-dire « induit t = 0 », « induit t = 10 min », « induit t = 20 min », etc. ; (Figure 1).
- Après 90 min d'incubation, lorsque la DO (densité optique) à 600 nm est comprise entre 0,1 et 0,2, ou au moment de l'induction spontanée minimale (voir la discussion), ajouter 4 µL d'acide acétique glacial à 1 % (v/v) au flacon non induit (Figure 1).
REMARQUE : Comme l'agent inducteur utilisé dans ce travail a été préparé avec de l'acide acétique glacial à 1 % comme solvant, la même quantité de solvant a été ajoutée seule comme étape contrôle. D'autres contrôles peuvent être envisagés selon la préparation d'autres inducteurs. - Ajouter la culture de 80 mL du flacon non induit à 720 mL de LB stérile, puis ajouter immédiatement la solution d'arrêt (phénol à 5 % [v/v] glacé, pH 4,3, éthanol à 95 % [v/v]) selon un volume représentant 20 % du volume de la culture (160 mL), et incuber sur glace pendant au moins 30 min et pas plus de 2 h afin de stabiliser les transcrits d'ARN. Cet échantillon est le témoin non induit.
- Induire les cultures restantes dans sept flacons de 250 mL (Figure 1) avec la CMIM (concentration minimale inhibitrice finale) d'un agent inducteur approprié (dans ce cas, de la norfloxacine à 25 mg·mL−1, préparée dans de l'acide acétique glacial à 1 % [p/v], utilisée à une concentration finale de 1 µg·mL−1), bien mélanger, puis incuber à 37 °C avec agitation à 180 tr/min pendant 1 h.
REMARQUE : Cette étape forcera la culture lysogène vers un état plus coordonné de réplication lytique. La majorité des cellules de la culture commenceront la production lytique de particules de phage infectieux. - Laisser les cellules se récupérer en ajoutant 80 mL de culture du flacon induit à 720 mL de LB stérile, ce qui dilue efficacement l'agent inducteur. Récolter les cellules bactériennes de chaque flacon toutes les 10 min à partir du temps 0 jusqu’à 1 h en ajoutant la solution d’arrêt, comme indiqué à l’étape 1.5.
REMARQUE : La solution d’arrêt stabilise l’ARN pendant jusqu’à 2 h. Toutefois, pour améliorer la stabilité des échantillons, effectuer toutes les étapes suivantes à 4 °C. - Récolter par centrifugation à 10 000 x g pendant 15 min à 4 °C dès que possible, sans dépasser 2 h après le traitement afin d’éviter la dégradation de l’ARN.
- Jeter le surnageant et resuspendre délicatement les culots bactériens dans le liquide résiduel à l’aide d’une pipette automatique réglable avant de transférer chaque échantillon dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
- Centrifuger les tubes microcentrifuges à grande vitesse (13 000 x g) dans une microcentrifugeuse à 4 °C pendant 1 min, puis jeter le surnageant résiduel.
- Congeler instantanément les culots en plongeant chaque tube microcentrifuge scellé dans de l’azote liquide. Cela facilitera une lyse cellulaire efficace pour l’extraction de l’ARN.
- Ajouter du TRIzol (1 mL) à chaque culot congelé et homogénéiser la suspension par pipetage (ne pas vortexer). Conserver à −80 °C jusqu’au moment de réaliser l’extraction de l’ARN pour tous les échantillons.
REMARQUE : Le protocole peut être interrompu à ce stade. - Répéter les étapes 1.1 à 1.13 avec trois réplicats biologiques.
Résultats
Figure 1 : Le schéma expérimental pour l'échantillonnage des cultures induites et non induites en vue de l'isolement de l'ARN.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| LES phages | Induits et purifiés à partir de LESB58 en utilisant la norfloxacine. | La présente étude | |
| Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
| Lysogeny Broth (LB) Agar | Merck | 1.10283.500 | |
| Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
| Top Agar | 0,4 g d'Agar Agar + 2,5 g de bouillon LB dans 100 mL d'eau ; stériliser par autoclavage et utiliser. | - | |
| Rifampicine | Sigma (Solution mère : 50 mg/mL dans le méthanol — Bien mélanger et stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm, puis conserver à -20 °C jusqu’à utilisation) | R3501 | |
| Acide acétique glacial | Fisher 1 % (v/v) dans l’eau | 10060000 | |
| Norfloxacine | Sigma (Solution mère : 25 mg/mL dans 1 % d’acide acétique glacial — Bien mélanger et stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm, puis conserver à -20 °C jusqu’à utilisation ; pour éviter les cycles de congélation-décongélation, conserver en petites aliquotes) | N9890 | |
| Phénol saturé avec tampon citrate pH 4,3 | Sigma | P-4682 | |
| Éthanol de qualité biologie moléculaire | Fisher | 16695992 | |
| TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
| Chloroforme | Fisher | 11398187 | |
| Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
| Eau exempte de nucléases | Invitrogen | 10526945 |
