Récolte du virus adéno-associé à partir de cellules mammaliennes transfectées

Résumé

Source : Rghei, A. D., et al. Production de vecteurs de virus associés aux adénovirus dans des empilements cellulaires pour des études précliniques chez des modèles animaux de grande taille. J. Vis. Exp. (2021)

Ce vidéo montre la récupération du virus adéno-associé brut à partir de cellules de mammifères transfectées en utilisant une lyse chimique et une centrifugation, permettant une production élevée d'AAV pour des applications de purification en aval et de thérapie génique préclinique.

Protocole

1. Récupération du VAA (virus associé aux adénovirus) et lyse chimique des cellules HEK293 (cellules rénales embryonnaires humaines 293) transfectées

1. Agiter vigoureusement la chambre de culture cellulaire pour détacher les cellules jusqu'à ce que le milieu apparaisse trouble en raison des cellules détachées, puis verser dans quatre tubes de centrifugation de 500 mL.
2. Centrifuger les tubes à 18 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour former un culot cellulaire. Verser le surnageant clarifié dans une bouteille de 1 L en copolyester de téryphtalate de polyéthylène (PETG).REMARQUE : Si l'on ne dispose pas d'une centrifugeuse à grande vitesse, centrifuger à 12 000 x g pendant 40 min. Les cellules en culot peuvent ne pas être compactes à cette vitesse et glisser lors de l'écoulement du surnageant.
3. Resuspendre les culots cellulaires dans des tubes de centrifugation de 500 mL avec 50 mL de tampon de lyse et incuber pendant 60 min à 37 °C.
4. Centrifuger les tubes à 18 000 x g pendant 30 min, puis transférer le surnageant dans la même bouteille de 1 L en PETG. Éliminer les débris cellulaires en culot.REMARQUE : Purifier immédiatement le surnageant clarifié et le conserver à 4 °C pendant un maximum de 72 h. Pour un stockage à long terme, le conserver à -80 °C. Ne pas stocker à -20 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Empileur de cellules à 10 compartiments	Corning	3271
Bouteille de 1 L en PETG	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM) contenant 1000 mg/L de D-glucose, L-glutamine	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Sérum de veau fœtal (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Cellules HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Après réception, décongeler les cellules et les cultiver selon les instructions du protocole du fabricant. Une fois que les cellules ont été peu de fois passagées et qu'elles se développent bien, congeler une sous-fraction en aliquots pour une utilisation ultérieure et les conserver dans l'azote liquide. Utiliser toujours des cellules ayant un numéro de passage inférieur à 30. Lorsque les cellules cultivées ont été passagées plus de 30 fois, il est recommandé de relancer une culture à partir des aliquots conservés
Support amortisseur pour tubes de centrifugation de grand volume	Corning	CLS431124	Le support amortisseur doit être utilisé avec les tubes de centrifugation de grand volume sauf si le rotor de la centrifugeuse dispose de cales adaptées en forme de V
Tubes de centrifugation de grand volume	Corning	CLS431123-6EA	Tubes de centrifugation de 500 mL