Transduction d'embryons fertilisés de rat via des vecteurs lentiviraux

Résumé

Source : Koza, P., et al. Génération de rats transgéniques à l'aide d'une approche par vecteur rétroviral lentiviral. J. Vis. Exp. (2020)

Ce vidéo montre la livraison assistée par microinjection de vecteurs lentiviraux dans des embryons de rat fécondés afin d'obtenir une intégration stable du transgène pour la génération de rats transgéniques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons animaux ont été examinées et approuvées par le comité d'éthique animal approprié.

1. Microinjection de vecteurs lentiviraux dans l'embryon au stade unidcellulaire sous la zone pellucide
   REMARQUE : Utiliser des embryons au stade unidcellulaire présentant deux pronoyaux visibles pour la microinjection (Figure 1).
   1. Dégeler l'aliquot de lentivirus (LV) à température ambiante et centrifuger à 10 000 x g et à température ambiante (TA) pendant 2 min afin de former un culot contenant les débris cellulaires résiduels.
   2. Configuration de la microinjection
      1. Préparer des pipettes de maintien en verre (capillaires en verre borosilicaté) à l'aide d'un microforge. Tirez le capillaire en verre au-dessus d'une flamme pour obtenir une pointe de 5 à 10 cm. Casser la pipette de manière à conserver une pointe d'environ 4 cm. Le diamètre extérieur doit être d'environ 80 à 120 µm.
         REMARQUE : Veiller à ce que la pointe de la pipette soit parfaitement droite et lisse.
      2. Monter la pipette étirée dans un microforge, la pointe étant placée devant le filament chauffant. Chauffer le filament très près de la pointe de la pipette et laisser rétrécir jusqu'à un diamètre d'environ 15 µm (environ 20 % de la taille de l'embryon). Positionner la pipette perpendiculairement au filament chauffant, à 2 à 3 mm de la pointe de la pipette, puis commencer à chauffer. Le verre va s'assouplir. Continuer à chauffer jusqu'à ce qu'un angle de 15° soit atteint.
      3. Préparer des capillaires en verre borosilicaté pour microinjection, équipés d'un filament, à l'aide d'un tireur de pipettes. Insérer le capillaire dans la chambre de traction. Effectuer un test de rampe (la première fois pour un nouveau verre et à chaque changement de filament). Régler la chaleur sur la valeur de rampe moins 10, la traction sur 100, la vitesse sur 150 et le temps sur 100.
         REMARQUE : Modifier les paramètres afin d'obtenir une pipette d'injection optimale.
      4. Sous une hotte de sécurité biologique à flux laminaire, charger environ 2 µL de la solution virale dans la pipette de microinjection à l'aide d'une micro-pointe de chargement.
      5. Préparer une boîte de microinjection (couvercle d'une boîte de Pétri de 60 mm) avec une goutte de 100 µL de milieu M2 (au centre), recouverte de paraffine liquide ou d'huile minérale.
      6. Monter la pipette de maintien et la capillaire de microinjection chargée de solution virale sur un micromanipulateur et la boîte de microinjection sous un microscope inversé.
   3. Réaliser la microinjection
      1. Transférer 15 à 20 embryons au stade unidcellulaire dans la goutte de milieu M2 sur la boîte de microinjection. Maintenir l'embryon à l'aide d'une pipette de maintien.
      2. À l'aide d'un grossissement de 400x, injecter la solution LV sous la zone pellucide, dans l'espace périvitellin, à l'aide du capillaire en verre relié à un injecteur automatique. Maintenir la pipette sous la zone pellucide pendant un instant.
         REMARQUE : Sous une pression positive douce, la solution virale s'écoule continuellement hors de la pipette d'injection, mais le volume de la suspension délivrée ne peut pas être contrôlé.
      3. À l'aide d'une pipette fine, replacer les embryons dans la boîte de culture dans l'incubateur à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO₂ . Le nombre d'injections par zygote peut varier et peut être adapté en fonction de la concentration du vecteur viral.
         REMARQUE : Les embryons injectés peuvent être transférés à des mères porteuses au stade unidcellulaire ou incubés toute la nuit dans du milieu M16 avant d'être transférés au stade bidcellulaire. Il convient d'éviter une culture in vitro prolongée des embryons de rat.

Résultats

Figure 1. Photographie microscopique d'un embryon de rat au stade uniloculaire préparé pour une injection subzonale de vecteur lentiviral. L'embryon a été immobilisé à l'aide d'une pipette de maintien. Deux pronoyaux contenant le matériel génétique maternel et paternel ainsi que le globule polaire sont visibles. Barre d'échelle = 20 μm.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ensembles de tubes d'aspiration pour pipettes microcapillaires étalonnées	Sigma	A5177-5EA
Capillaires en verre borosilicaté avec filament GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	Pipette d'injection
Plaque de culture cellulaire CELLSTAR, 35 mm	Greiner Bio-One	627160
Plaque de culture cellulaire CELLSTAR, 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Huile minérale	Sigma	M8410-500ML
Microscope inversé	Zeiss	Axiovert 200
Milieu M2	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	Pipette porte-capillaire
Milieu M16 EmbryoMax	Sigma	MR-016-D