Purification de l'intégrase virale par chromatographie d'affinité

Résumé

Source : Lopez Jr., M. A., et al. Détection et élimination de la contamination par les nucléases lors de la purification de l'intégrase recombinante du virus foamy prototype. J. Vis. Exp. (2017)

Ce vidéo montre la purification de l'intégrase virale marquée par une polyhistidine à l'aide d'une chromatographie d'affinité au nickel. Le protocole utilise une élution par gradient d'imidazole pour isoler sélectivement l'intégrase en fonction de son affinité pour la résine chargée en nickel.

Protocole

1. Chromatographie d'affinité au nickel

1. Dégeler un culot bactérien sur de la glace.
   REMARQUE : Cela prendra un temps considérable (environ 2 à 3 heures). Lorsque le culot est décongelé en une suspension cellulaire, ajouter un supplément de 500 μM Phénylméthanesulfonyl fluorure (PMSF) (solution mère à 100 mM).
2. Garder le tube de 50 mL contenant la suspension bactérienne sur de la glace. Soniquer les bactéries à une amplitude de 30 % pendant 30 s (1 s activé, 1 s inactif) par culot provenant d'une culture de 1 L, à l'aide d'un sonicateur équipé d'une sonde bio de 0,5 inch de diamètre munie d'une micro-pointe conique de 0,125 inch de diamètre, d'une fréquence de 20 kHz et d'une puissance maximale de 400 W.
3. Transférer l'échantillon cellulaire dans un tube d'ultracentrifugation refroidi. Utiliser des ensembles de flacons en polycarbonate (25 mm de diamètre, 89 mm de hauteur) compatibles avec un rotor à angle fixe de type 60 Ti. D'autres tubes et rotors peuvent être utilisés si la même force gravitationnelle est obtenue. Centrifuger à 120 000 x g pendant 60 min à 4 °CIl devrait y avoir un culot bien visible. Le surnageant peut présenter une couleur jaune.
4. Transférez le surnageant par versement ou pipetage dans un tube conique de 50 mL prérefroidi. Notez le volume ; ce volume doit être approximativement égal au volume de tampon de resuspension utilisé avant la congélation rapide. Si le surnageant est visqueux, il pourrait être contaminé par de l'ADN bactérien susceptible d'obstruer la colonne de chromatographie. Dans ce cas, répétez l'ultracentrifugation afin de former un culot d'ADN bactérien.
5. Préparer 500 mL de tampon A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) et 500 mL de tampon B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazole).
   REMARQUE : Dans ce protocole, maintenir le système de chromatographie liquide à haute performance (FPLC), tous les tampons et l'échantillon à 4 °C dans une chambre froide.
   1. Filtrer stérilement les tampons A et B avec 0.2 μm unités filtrantes jetables. Selon le système FPLC, rincer la pompe A et la pompe B respectivement avec le tampon A et le tampon B. Faire circuler 90 % de tampon A et 10 % de tampon B à travers le système jusqu'à stabilisation des mesures de conductivité et d'ultraviolets (UV). Le débit maximal dépend de l'instrument ; utiliser un débit de 5 mL/min avec une limite de pression maximale de 1,0 MPa.
6. Préparer une colonne FPLC de 110 mm de longueur et de 5 mm de diamètre, chargée avec 1,5 mL de résine au nickel (capacité maximale de liaison 50 mg/mL, pression maximale 1 MPa). La colonne peut être préparée la veille de la purification et conservée à 4 ˚C.
7. Connecter la colonne à l'instrument FPLC. Équilibrer la colonne avec 20 mL de 90 % tampon A et 10 % tampon B (20 mM d'imidazole) à un débit de 0,5 mL/min avec une pression maximale de 0,5 MPa. L'instrument doit enregistrer en temps réel les données de conductivité et d'absorbance UV à 280 nm (A₂₈₀). La conductivité et les mesures UV doivent se stabiliser. Si ces mesures ne sont pas stables, continuer à faire circuler les tampons à travers la colonne jusqu'à obtention de valeurs stables.
8. Chargez l'échantillon protéique (~10 mL par culot) sur la colonne à un débit de 0,15 mL/min avec une pression maximale de 0,5 MPa. Le débit et la pression de la colonne restent constants tout au long de la purification. Récupérez le flux sortant dans un tube de 50 mL.
   1. Lavez la colonne avec 20 mL de tampon A à 90 % et de tampon B à 10 %. Recueillez le lavage dans un tube de 50 mL. Éluisez les protéines à l’aide d’un gradient linéaire de 20 mL passant de 10 % à 100 % de tampon B (20 mM à 200 mM d’imidazole).
   2. Enfin, lavez la colonne avec 5 mL de tampon B à 100 % (200 mM d’imidazole). Collectez le gradient et le lavage final en fractions de 0,27 mL.
9. Combiner 15 μL de tampon d'échantillonnage SDS-PAGE 2x avec 15 μL du flux sortant, du lavage et du pic A₂₈₀ fractions. Faire bouillir les échantillons pendant 3 min.
   1. Préparer deux gels de SDS-PAGE à 10 %. Charger 10 μL de chaque échantillon sur les gels et 4 μL de standards protéiques précolorés. Faire migrer, colorer et analyser les gels.
   2. Combiner les fractions qui semblent contenir une intégrase du virus foamy prototype (PFV IN) presque pure, selon l'inspection visuelle. Mesurer le volume par pipetage, généralement entre 8 et 10 mL.
   3. À l'aide d'un spectrophotomètre, mesurer l'absorbance à 280 nm (A280) des fractions combinées et calculer la quantité totale de protéine d'intégrase du virus foamy prototype (PFV IN) ; le rendement typique est d'environ 10 mg par litre de culture induite. Le coefficient d'extinction de la PFV IN portant la marque hexahistidine est de 59360 cm-1 M-1.₂₈₀ des fractions combinées et calculez la quantité totale de protéine PFV IN ; le rendement typique est d'environ 10 mg par litre de culture induite. Le coefficient d'extinction de la PFV IN portant la marque hexahistidine est de 59360 cm⁻¹·M⁻¹.^-1 M^-1.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
E. coli BL21/DE3 Rosetta	EMD Millipore	70956-4
Imidazole	Sigma-Aldrich	I0250
Résine Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430