Purification de l'intégrase virale par chromatographie d'affinité à l'héparine

Résumé

Source : Lopez Jr., M. et al. Détection et élimination de la contamination par les nucléases lors de la purification de l'intégrase recombinante du virus foamy prototype. J. Vis. Exp. (2017)

Ce vidéo montre la procédure de purification de l'intégrase virale à partir de la contamination par des nucléases bactériennes à l'aide d'une chromatographie sur colonne à sépharose héparine, suivie d'une analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) afin de confirmer la pureté de la protéine.

Protocole

1. Chromatographie d'affinité à l'héparine
   1. Préparer 250 mL du tampon C (50 mM de chlorure de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris-HCl), pH 7,5, 10 mM de dithiothréitol (DTT), 0,1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 500 μM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)) et 250 mL du tampon D (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de DTT, 0,1 mM d'EDTA, 500 μM de PMSF, 1 M de NaCl).
      REMARQUE : Dans ce protocole, le système de chromatographie liquide à haute performance (FPLC), les tampons et l'échantillon sont conservés dans une chambre froide à 4 ˚C.
      1. Filtrer stérilement les tampons C et D à l’aide d’unités filtrantes jetables de 0,2 μm. Selon le système FPLC, rincer la pompe A et la pompe B respectivement avec le tampon C et le tampon D. Faire circuler 80 % de tampon C et 20 % de tampon D à travers le système jusqu’à stabilisation des mesures de conductivité et d’ultraviolets (UV). Le débit maximal dépend de l’appareil ; nous utilisons couramment un débit de 5 mL/min avec une limite de pression maximale de 1,0 MPa.
   2. Préparer une colonne FPLC de 80 mm de longueur et 5 mm de diamètre contenant 1 mL de résine Sepharose à l’héparine (capacité maximale de liaison de 2,0 mg d’antithrombine III bovine par mL de résine ; pression maximale 1,4 MPa). La colonne peut être préparée la veille de la purification et conservée à 4 °C. Connecter la colonne à l’appareil FPLC.
      1. Équilibrer la colonne avec 20 mL de 80 % de tampon C et 20 % de tampon D (200 mM de NaCl) à un débit de 0,5 mL/min avec une limite de pression maximale de 1 MPa. L’appareil doit enregistrer en temps réel les données de conductivité et d’absorbance UV à 280 nm (A₂₈₀). Les mesures de conductivité et UV doivent se stabiliser. Si ces mesures ne sont pas stables, continuer à faire circuler les tampons à travers la colonne jusqu’à stabilisation.
   3. Réduire la concentration de NaCl de l’échantillon d’intégrase du virus foamy prototype (PFV IN) à 200 mM en ajoutant 1,5 volume du tampon C. Par exemple, ajouter 15 mL de tampon C à 10 mL de PFV IN. Notre volume total est généralement d’environ ~25 mL.
   4. Charger l’échantillon de PFV IN dilué sur la colonne de Sepharose à l’héparine à un débit de 0,5 mL/min avec une limite de pression maximale de 1,0 MPa. Le débit et la pression de la colonne restent constants tout au long de la purification. Recueillir l’écoulement direct dans un tube conique de 50 mL.
      1. Laver la colonne avec 20 mL de 80 % de tampon C et 20 % de tampon D (200 mM de NaCl), en récupérant le lavage dans un tube conique de 50 mL. Éluer la colonne avec un gradient linéaire de 30 mL allant de 20 % à 100 % de tampon D (200 mM à 1 M de NaCl).
      2. Laver la colonne avec 5 mL de tampon D à 100 %. Recueillir le gradient et le lavage final en fractions de 0,37 mL.
   5. Analyser la charge, l’écoulement direct, le lavage et les fractions par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium à 8 % (SDS-PAGE). La PFV IN, après clivage de la marque hexahistidine, a une masse moléculaire de 44 394 Da, et le coefficient d’extinction reste de 59 360 cm^-1 M^-1 en l’absence de la marque hexahistidine. Conserver toutes les fractions à 4 ˚C jusqu’à la réalisation d’un dosage des nucléases.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) β-D-1-thiogalactopyranoside	Denville Scientific	CI8280
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF (fluorure de phénylméthanesulfonyle)	Amresco	754
DTT (dithiothréitol)	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Héparine Sepharose 6 à flux rapide	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01