Ce vidéo décrit le dosage de plaques virales à l'aide de particules de pseudovirus de coronavirus. Le pseudovirus dilué est ajouté sur une monocouche de cellules de mammifères, suivie d'une incubation avec une couche de méthylcellulose. Les plaques formées par les cellules infectées sont comptées visuellement afin de déterminer la concentration infectieuse du virus.
Article de méthode
Quantification des particules de pseudovirus par essai de plaque
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30 septembre 2026
Dans cet article
Résumé
Protocole
Titration du virus de la stomatite vésiculaire exprimant la protéine de spicule du coronavirus et la protéine fluorescente verte améliorée (pseudovirus VSV-S-eGFP)
1. Dilution sérielle pour déterminer le titre viral
1. Ensemencer les cellules Vero E6 dans des plaques 6-puits à une densité de 6 × 105 cellules par puits dans le milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM) (avec 10 % de FBS (sérum de veau fœtal)), puis incuber toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO₂.
REMARQUE : Les cellules Vero surexprimant TMPRSS2 et hACE2 peuvent également être utilisées.
2. Préparer une série de dilutions sérielles d’un facteur 10 du virus VSV-SeGFP dans du DMEM froid sans sérum en ajoutant 900 μL de milieu dans sept tubes microcentrifuge. Numéroter les tubes de 1 à 7. Ajouter 100 μL de la souche virale dans le premier tube et vortexer brièvement. Transférer 100 μL de virus dilué du tube 1 au tube 2 et vortexer brièvement ; répéter jusqu’au tube 7.
3. Aspirer le milieu de tous les puits de la plaque 6 puits contenant les cellules Vero E6, puis remplacer par 500 μL de dilutions allant de 105 à 107. Incuber les plaques pendant 45 min à 37 °C avec 5 % de CO₂, en agitant doucement toutes les 15 min.
Aspirer l'inoculum et le remplacer par une couche recouvrante contenant un mélange 1:1 de DMEM 2x et de carboxyméthylcellulose (CMC) à 6 %, concentration finale de 3 % de CMC, supplémentée avec 10 % de SFB ; incuber à 34 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 h.
REMARQUE : Préchauffer le mélange de recouvrement dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min pendant l'étape d'infection. Un mélange 1:1 d'agarose à 1 % avec du DMEM 2x supplémenté en 10 % de SFB peut être utilisé à la place du CMC. Pour le recouvrement à l'agarose, faire bouillir l'agarose à 1 % (dans de l'eau distillée) et la mélanger avec du DMEM 2x froid. S'assurer que le mélange est à une température appropriée avant de l'ajouter à la monocouche cellulaire (environ 37-40 °C). Si l'agarose est utilisée pour le recouvrement, les cellules doivent être fixées par incubation dans 2 mL d'un mélange méthanol : acide acétique à 3:1 pendant au moins une heure avant la coloration.
2. Coloration et calcul du titre viral
1. Visualiser les plaques en les colorant au violet de crésyl ou par visualisation directe de l'eGFP au microscope à fluorescence.
2. Pour colorer les plaques, aspirez la couche de recouvrement, rincez une fois avec du PBS, puis ajoutez 2 mL de violet de crésyl à 0,1 % (dans 80 % de méthanol et d’eau distillée) dans chaque puits. Incubez sur un agitateur rotatif pendant environ 20 min à température ambiante avant la décoloration. Éliminez le violet de crésyl et rincez délicatement chaque puits deux fois avec de l’eau distillée ou du PBS.
REMARQUE : Les étapes de lavage et de coloration doivent être effectuées délicatement en pipetant lentement sur le côté de chaque puits afin de garantir l'intégrité de la monocouche cellulaire tout au long de la procédure.
3. Laisser sécher les plaques pendant au moins 1 h avant de compter les plaques. S'assurer que les décomptes de plaques sont effectués à partir de puits contenant entre 20 et 200 plaques. Pour calculer le titre du virus en unités formant des plaques (PFU) par mL, multiplier le facteur de dilution du puits compté par le volume d'infection, puis diviser ce nombre par le nombre de plaques présentes dans le puit correspondant.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| trypsine-EDTA à 0,25 % (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| Cellules Vero E6 | ATCC | CRL-1586 | |
| cellulose carboxyméthylée | Sigma | C5678 | |
| Milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco (poudre) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| Pénicilline/streptomycine | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Anticorps neutralisant de la protéine Spike du SARS-CoV-2 (2019-nCoV), IgG de souris | SinoBiological | 40592-MM57 |
