Neutralisation médiée par des anticorps de pseudovirus exprimant la protéine Spike du coronavirus à l'aide de sérums de patients

Résumé

Source : Jamieson, T. R., et al. Détection des anticorps neutralisants de SARS-CoV-2 par imagerie fluorescente à haut débit de l'infection par pseudovirus. J. Vis. Exp. (2021)

Ce vidéo montre la neutralisation médiée par les anticorps de pseudovirus portant des protéines Spike de coronavirus à l'aide de sérum de patient, étudiée par imagerie fluorescente à haut débit de monocouches de cellules épithéliales infectées.

Protocole

Toutes les procédures impliquant la collecte d'échantillons ont été réalisées conformément aux lignes directrices du comité d'éthique de l'institut.

1. Dilutions des anticorps ou des sérums et infections

REMARQUE : Ce protocole peut être utilisé pour mesurer la neutralisation du virus de la stomatite vésiculeuse exprimant la protéine de spicule du coronavirus et la protéine fluorescente verte améliorée (VSV-S-eGFP), un pseudovirus, par des anticorps disponibles dans le commerce et des sérum de patients, ainsi que par des séra prélevés sur des animaux dans le cadre d'études de développement préclinique de vaccins.

1. Série de dilutions sérielles
   1. Avant de diluer les échantillons sériques, inactiver chaque échantillon par chauffage dans un bain-marie à 56 °C pendant 30 min afin d'inactiver le complément. Prendre les précautions de sécurité nécessaires lors de la manipulation des échantillons de patients ; n'ouvrir les récipients d'échantillons qu'à l'intérieur de la hotte de culture cellulaire, et porter des équipements de protection individuelle adaptés au niveau de confinement 2.
   2. Préparer la série de dilutions dans une plaque vide de 96 puits (Plaque 1).
   3. Commencer toutes les dilutions dans la rangée A de la plaque de 96 puits avec un volume de 80 µL. *Pour les échantillons de patients, débuter la série de dilutions au rapport 1 sur 10 en plaçant 8 µL de sérum dans 72 µL de milieu de Dulbecco modifié (DMEM) sans sérum (avec 1 % de pénicilline/streptomycine).
      REMARQUE : La concentration d'anticorps neutralisant utilisée dépendra de l'activité prévue par le fabricant. Pour l'anticorps neutralisant Spike du SARS-CoV-2 utilisé ici (voir le Tableau des matériaux), commencer à 5 µg/mL afin d'observer au moins 50 % de neutralisation.
   4. Ajouter 40 µL de DMEM sans sérum (avec 1 % de pénicilline/streptomycine) aux rangées B à G, et 80 µL à la rangée H. Ne pas ajouter de virus à la rangée H, car elle sert de témoin sans virus (témoins cellulaires uniquement).
   5. À l’aide d’une pipette multicanal à 12 canaux, mélanger et transférer 40 µL de sérum ou d’anticorps dilué de la rangée A vers la rangée B. Mélanger et répéter jusqu’à la rangée F, puis jeter 40 µL provenant de la rangée F. Ne pas ajouter de sérum à la rangée G, car elle correspond à la rangée témoin virus uniquement.
2. Infection et recouvrement
   1. Préparer un volume approprié de VSV-S-eGFP dilué afin de traiter chaque puit à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,05 (ou 2000 unités formant des plaques (pfu)). (Lors du calcul, garder à l'esprit que seul 60 µL du volume total de 80 µL sera transféré sur les cellules ; par conséquent, multiplier le volume de virus par 1,33 pour maintenir 2000 pfu).
      REMARQUE : Le VSV-S-eGFP étant sensible à la température, veiller à ce que les stocks viraux restent sur glace lorsqu'ils ne sont pas utilisés, et éviter les cycles répétés de congélation-décongélation car les titres varient après plusieurs congélations.
   2. Ajouter 40 µL de virus dilué dans chaque puit des rangées A à G de la Plaque 1 et mélanger par aspiration et expulsion 4 à 5 fois. Incuber la plaque pendant 1 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   3. Retirer la plaque contenant les cellules de l'incubateur (Plaque 2) et aspirer soigneusement le milieu de tous les puits. Transférer 60 µL du mélange anticorps/virus de la Plaque 1 vers la Plaque 2, puis incuber pendant 1 h à 37 °C avec 5 % de CO₂, en agitant doucement la plaque toutes les 20 min.
   4. Compléter chaque puit avec 140 µL de milieu de recouvrement contenant de la carboxyméthylcellulose (CMC) dans du DMEM, pour une concentration finale de 3 % de CMC (avec 10 % de FBS (sérum de veau fœtal) et 1 % de pénicilline/streptomycine). Placer la Plaque 2 dans un incubateur réglé à 34 °C avec 5 % de CO₂ pendant environ 24 h avant l'acquisition d'images.
      REMARQUE : Préchauffer le mélange de recouvrement dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min durant l'étape d'infection.

2. Imagerie et quantification (jour 3)

1. Imager les plaques à l'aide d'un lecteur de fluorescence automatisé (en utilisant un filtre fluorescéine isothiocyanate (FITC) ou un filtre alternatif avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm). Quantifier l'infection virale en créant un protocole qui identifie et compte automatiquement les foyers individuels d'eGFP (protéine fluorescente verte améliorée). Si une fonction de comptage automatique n'est pas disponible, utiliser le logiciel ImageJ pour quantifier le nombre de foyers d'eGFP.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellulose carboxyméthylée	Sigma	C5678
Milieu de Dulbecco modifié (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
Milieu de Dulbecco modifié (poudre) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Cellules Vero E6	ATCC	CRL-1586
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV