Suivi de l'expression génique spécifique à chaque stade du virus vaccinia à l'aide de rapporteurs fluorescents

Résumé

Source : Rozelle, D. K., et al. Virus rapporteurs de vaccinia pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l'expression génique. J. Vis. Exp. (2014)

Ce vidéo montre une méthode permettant de surveiller la réplication du virus vaccinia à l'aide de marqueurs fluorescents régulés par des promoteurs spécifiques à chaque étape. L'expression séquentielle de protéines fluorescentes vertes, rouges et bleues marque les phases précoce, intermédiaire et tardive de l'infection, permettant une analyse en haut débit de l'expression génique virale spécifique à chaque étape.

Protocole

1. Ensemencer les cellules

1. Dissocier les cellules HeLa à partir de la plaque et les diluer dans un milieu de croissance (milieu de Dulbecco modifié [DMEM], 2 mM L-glut, 10 % de sérum bovin fœtal [FBS]) à environ 2,0 x 10⁵ cellules/ml. Distribuer 100 μl/puits dans une plaque 96 puits à fond plat transparent et parois noires (20 000 cellules/puits).
2. Incuber les cellules pendant 24 heures jusqu'à confluence dans un incubateur à 37 °C + 5 % CO₂.

2. Infecter les cellules

1. Diluer les virus et infecter les cellules.
   1. Décongeler le virus TrpV (virus triple ; Venus précoce, mCherry intermédiaire, TagBFP tardif) et le virus fluorescent PLV (Venus sans promoteur), puis désagréger par sonication pendant 5 minutes. Alternativement, les stocks bruts de virus peuvent être mélangés au ratio 1:1 avec de la trypsine à 0,25 mg/ml dans le milieu d'infection et incubés à 37 °C pendant 30 min.
   2. Diluer les stocks bruts de virus dans du milieu d'infection à 37 °C (DMEM, 2 mM L-glut, 2 % FBS). Pour des infections à fort MOI (10 PFU/cellule), diluer le stock viral à 1,0 x 10⁷ PFU/ml en supposant 5 x 10⁴ cellules/puits et un volume d'inoculum de 50 μl. Prévoir l'infection de 3 puits réplicats pour chaque traitement avec TrpV et de 3 autres puits réplicats pour le même traitement avec PLV afin de tenir compte de la fluorescence de fond propre à chaque traitement.
   3. Infecter les puits en ajoutant 50 μl/puits de virus dilué dans le milieu d'infection. Ceci correspond au temps = 0 heure post-infection (0 hpi).
2. Incuber de 6 à 24 heures dans une étuve à 37 °C + 5 % CO₂.

3. Fixer les cellules

1. Fixer les cellules en ajoutant 100 μl de paraformaldéhyde à 8 % au milieu d'infection déjà présent dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 15 min à l'abri de la lumière.
   REMARQUE : Il est recommandé d'ajouter directement du paraformaldéhyde 2x (8 %) au milieu d'infection afin d'éviter l'aérosolisation du vaccinia infectieux, qui peut survenir si le milieu à haute concentration est renversé directement dans la cuve de déchets avant la fixation.
2. Éliminer le fixateur en retournant la plaque dans la cuve de déchets.
3. Ajouter 100 μl de solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante.
4. Fermer la plaque avec un film adhésif optiquement transparent.
   REMARQUE : Les plaques peuvent être conservées à 4 °C si elles ne sont pas lues immédiatement. Veiller à ramener les plaques scellées à température ambiante avant la lecture afin d'éviter que la condensation ne perturbe les mesures du spectrophotomètre.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)	Gibco	11995-065
Sérum bovin fœtal - Optima, inactivé par la chaleur (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
L-Glutamine 200 mM (L-glut)	Gibco	25030-081
Microplaques en polystyrène noir, traitées pour la culture de cellules, 96 puits, fond clair et plat	Corning	3603
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	10010-023
Film optiquement transparent TempPlate RT	USA Scientific	2978-2700
Milieu Opti-MEM à faible teneur en sérum	Gibco	31985-070