Isolement et purification de virus à partir de corps d'insectes infectés

Résumé

Source : Biesbrock, A. M. et al. Multiplication du Homalodisca coagulata virus-01 par culture cellulaire de Homalodisca vitripennis. J. Vis. Exp. (2014)

Cette vidéo démontre la propagation in vitro du virus Homalodisca coagulata-01 à l'aide de cellules hôtes d'origine insecte. Elle décrit les étapes de purification du virus, d'inoculation et de réplication au sein de cellules insectes en culture.

Protocole

1. Extraction du virus entier

1. Homogénéiser les corps entiers de H. vitripennis positifs au virus dans un tampon phosphate, pH ~7,2, contenant 0,02 % de diéthyldithiocarbamate de sodium trihydraté (DETCA) par vortexage par intervalles d’environ 10 secondes jusqu’à disparition des gros agrégats de tissu. Extraire le virus par ultracentrifugation à 124 500 x g pendant 4 heures à 4 °C ou à 22 000 x g pendant 16 heures à 4 °C. Si un précipité se forme en surface, l’éliminer à l’aide d’un coton-tige stérile.
2. Jeter le surnageant.
3. Recueillir le culot et le dissoudre dans 5 ml de tampon phosphate 10 mM (sans DETCA), pH ~7,2, contenant 0,4 % d’acide Na-désoxycholique et 4 % d’éther d’hexadécyl polyéthylène glycol (Brij 52).
   1. Pour bien mélanger le culot, le détacher de la paroi du tube et le broyer jusqu’à dissolution complète, si nécessaire.
   2. Ajouter du tampon phosphate 10 mM par incréments d’environ 5 ml pour faciliter la dissolution du culot si besoin, puis réunir dans 2 tubes.
4. Centrifuger la solution à 300 x g pendant 15 minutes.
5. Éliminer le surnageant et faire passer la solution à travers un filtre de 0,45 μm, puis recueillir le filtrat dans un tube de collecte de grande taille.
6. Transférer le filtrat dans une membrane de dialyse ayant une coupure de poids moléculaire (MWCO) de 3,5 kD, en utilisant de petites quantités de tampon phosphate 10 mM (pH 7) sans DETCA si nécessaire.
7. Placer la membrane de dialyse dans un grand bécher rempli d’eau doublement distillée (ddH₂O) à 4 °C. Changer l’eau ddH₂O toutes les heures pendant 5 à 6 heures, jusqu’à formation d’un précipité blanc dans la membrane.
8. Recueillir le virus purifié à l’intérieur de la membrane et soumettre la solution virale à 100 % à une série de dilutions décimales en ajoutant 10 μl de solution à 90 μl de ddH₂O. Ensuite, ajouter 10 μl de la dilution à 90 μl supplémentaires de ddH₂O jusqu’à obtenir une dilution finale de 1:100 000.
9. Conserver la solution virale à -80 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Flacons de culture cellulaire Corning	Sigma Aldrich	CLS430168	Surface de 25 cm², col incliné, bouchon (joint à bouchon)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Microscope inversé et caméra
Plaques de culture multipuits Greiner CELLSTAR	Sigma Aldrich	M8937	48 puits (traités pour culture cellulaire, avec couvercle)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Trihydraté de diéthyldithiocarbamate de sodium
Système de filtration sous vide à embout bouteille Corning	Sigma Aldrich	CLS431206	Mémbane d'acétate de cellulose, taille des pores 0,45 μm, surface de la membrane 54,5 cm², capacité de filtration 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polyéthylène glycol hexadécyl éther
Solution tampon phosphate	Sigma Aldrich	P5244	Fournie à 100 mM, diluée à 10 mM avec de l'eau stérile
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Solution saline tamponnée au phosphate
Sérum albumine bovine (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Milieu pour insectes de Grace (supplémenté, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
L-histidine monohydratée	Sigma Aldrich	H8125	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
Milieu 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
Milieu 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
Sels équilibrés de Hank (1x)	Sigma Aldrich	51322C	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
L-Glutamine (100x)	Sigma Aldrich	G3126	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
Milieu MEM, mélange d'acides aminés (50x)	Sigma Aldrich	56419C	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
Solution de MgCl 1 M	Sigma Aldrich	M8266	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
Nystatine	Sigma Aldrich	N6261	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
Gentamicine	Sigma Aldrich	46305	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles
Sérum fœtal bovin	Sigma Aldrich	F2442	Constituant du milieu H2G+ pour cicadelles