Ce vidéo montre la production et la concentration de lentivirus recombinants dans des cellules de mammifères, permettant une livraison efficace de gènes de facteurs de transcription ou d'autres éléments génétiques pour des applications telles que le reprogrammation cellulaire, des études fonctionnelles et des recherches thérapeutiques potentielles.
Article de méthode
Génération de lentivirus recombinants dans des cellules mammaliennes
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30 septembre 2026
Dans cet article
Résumé
Protocole
1. Construction d'un système concentré d'emballage de lentivirus pour les facteurs de transcription
- Production du virus concentré (Figure 1A, B)
- Plaquer 1,5 × 10⁶ cellules HEK (rein embryonnaire humain)-293T dans une boîte de culture de 60 mm et cultiver ces cellules avec le milieu normal (voir tableau 1) à 37 °C dans un incubateur humide avec 5 % de CO₂. × 106 des cellules HEK (rein embryonnaire humain)-293T dans une boîte de 60 mm et cultiver ces cellules avec un milieu normal (voir Tableau 1) à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂2.
REMARQUE : Si le virus doit être emballé par lots, une boîte de culture cellulaire de 100 mm peut être utilisée (pour plus de détails, voir Tableau 2). - Après 24 h, s'assurer que les cellules HEK-293T ont atteint une confluence de 80 à 90 % le jour de la transduction, puis remplacer le milieu par 3,5 mL de DMEM (milieu de Dulbecco modifié de l’aigle) (150 µL de DMEM par 1 cm2). Laisser les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂2 pendant 2 h.
REMARQUE : Le milieu de remplacement doit être sans sérum, afin que les cellules puissent être "privées de sérum" pour une transfection plasmidique optimale. - Préparer le mélange de plasmides (mélange A) contenant 3 µg des plasmides cibles Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 ou Snai2 ; 1 µg du plasmide d'emballage PMD2.G, et 2 µg du plasmide d'emballage PSPAX2. Compléter le volume du mélange A à 150 µL avec du DMEM sans sérum. Préparer le mélange du réactif de transfection (mélange B) en ajoutant 12 µL du réactif de transfection (le volume est deux fois la masse totale de tous les plasmides), et compléter le volume du mélange B jusqu'à 150 µL avec du DMEM sans sérum.
REMARQUE : Lors de la préparation des mélanges, il est important d'ajouter le liquide lentement afin d'éviter la formation de bulles d'air. - Combiner le mélange A et le mélange B après les avoir laissés reposer 5 min à température ambiante. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 à 30 min afin de former le complexe de transfection.
- Sortir les cellules HEK-293T de l'incubateur, remplacer le milieu par du DMEM + 2 % de FBS (sérum bovin fœtal), ajouter goutte à goutte le mélange de l'étape 1.1.4 et mélanger doucement le liquide.
- Après 8 h, remplacer le milieu par 3,5 mL de milieu normal. Après le changement de milieu, recueillir le surnageant viral à 24 h et à 48 h.
- Mélanger les surnageants viraux recueillis à deux moments différents. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C. × g pendant 5 min à 4 °C. Faire passer le surnageant à travers 0.45 µm filtrer et recueillir dans un tube conique stérile de 50 mL.
REMARQUE : Le virus collecté à 24 h peut être conservé à 4 °C et mélangé avec le virus collecté à 48 h. - Concentrer le surnageant viral par centrifugation à 6000 × g à 4 °C pendant une nuit (~16 h). S'assurer qu'un culot viral est visible au fond du tube conique après la centrifugation. × g à 4 °C pendant la nuit (~16 h). S'assurer que le culot viral est visible au fond du tube conique après la centrifugation.
- Verse le surnageant lentement. Dissoudre le culot viral dans un volume de milieu normal équivalent à 1/100th du volume du surnageant viral. À l’aide d’une micropipette P1000, effectuer des pipetages doux de montée et de descente jusqu’à obtention d’un mélange homogène. Répartir le virus concentré dans des tubes microcentrifugés selon les besoins. Conserver à −80 °C.
REMARQUE : Le virus est concentré 100 fois par cette méthode. Le virus concentré (100x) peut être conservé pendant >1 an à −80 °CÉviter les cycles répétés de congélation et de décongélation du virus.
- Plaquer 1,5 × 10⁶ cellules HEK (rein embryonnaire humain)-293T dans une boîte de culture de 60 mm et cultiver ces cellules avec le milieu normal (voir tableau 1) à 37 °C dans un incubateur humide avec 5 % de CO₂. × 106 des cellules HEK (rein embryonnaire humain)-293T dans une boîte de 60 mm et cultiver ces cellules avec un milieu normal (voir Tableau 1) à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂2.
Tableau 1 : Composants des milieux normal et de reprogrammation.
| Composants | Dose (concentration, volume) | Concentration finale | |
| Milieu normal (100 mL) | DMEM/HIGH GLUCOSE | 89 mL | |
| Sérum FBS inactivé par la chaleur | 10 mL | ||
| Antibiotiques (Pen/Strep) | 10000 U/mL, 1 mL | 100 U/mL | |
| Milieu de reprogrammation (100 mL) | RPMI-1640 | 88 mL | |
| Sérum FBS inactivé par la chaleur | 10 mL | ||
| SCF humain recombinant | 200 μg/mL, 50 μL | 100 ng/mL | |
| bFGF humain recombinant | 4 μg/mL, 250 μL | 10 ng/mL | |
| Insuline humaine recombinante | 10 mg/mL, 50 μL | 5 μg/mL | |
| EDN3 humain | 100 μM, 100 μL | 0,1 μM | |
| Toxine cholérique | 0,3 mg/mL, 0,56 μL | 20 pM | |
| Phorbol 12-myristate 13-acétate (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| Hydrocortisone | 100 μg/mL, 500 μL | 0,5 μg/mL | |
| Adénine | 40 mg/mL, 60 μL | 24 μg/mL |
Tableau 2 : Détails du système d’emballage de lentivirus.
| Plaque de culture | Densité d'ensemencement (cellules/plaque) | Milieu (mL) | Système de plasmide | Réactif de transfection (µL) | ||
| Plasmide cible (μg) | PMD2.G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 mm | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 mm | 1.5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 mm | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Résultats
Figure 1 : Production du virus concentré et estimation du titre. (A) Intensité de fluorescence de la GFP (protéine fluorescente verte) après infection des cellules HEK-293T par un lentivirus non concentré (1x) et un lentivirus concentré (100x). (B) Comparaison des taux d'infection du lentivirus non concentré (1x) et du lentivirus concentré (100x), mesurés par cytométrie en flux. (C) Estimation du titre du lentivirus concentré. Échelles = 250 µm. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte ; TU = unités de transduction.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Filtre de 0,45 µm | Millipore | SLHVR33RB | |
| Éthanol à 95 %/100 % | LANBAO | 210106 | Conserver à température ambiante |
| Antibiotiques (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Conserver à -20 °C |
| Anticorps anti-TRP2/DCT | Abcam | ab74073 | Hôte/isotype : IgG de lapinRéactivité d'espèce : souris/hommeDilution utilisée : 1/200 |
| DMEM (glucose élevé) | HyClone | SH30243.01 | Conserver à 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Conserver à température ambiante |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Conserver à -20 °CInactiver par la chaleur avant utilisation |
| Gélatine | Sigma | G9391 | Conserver à température ambiante |
| Plasmides GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 et Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Conserver à -20 °C |
| Hématoxyline | Abcam | ab220365 | Conserver à température ambiante |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Réactif de transfection, conserver à 4 °C |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Conserver à température ambiante |
| Phorbol 12-myristate 13-acétate (TPA) | Sigma | P8139 | Concentration stock : 1 mMConcentration finale : 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | Réactif cationique polymérique pour transfection ; Concentration stock : 8 µg/µLConcentration finale : 4 ng/µL |
| Puromycine | Gibco | A11138-03 | Conserver à -20 °C |
| bFGF humain recombinant | Invitrogen | 13256-029 | Concentration stock : 4 µg/mLConcentration finale : 10 ng/mL |
| Insuline humaine recombinante | Sigma | I3536 | Concentration stock : 10 mg/mLConcentration finale : 5 µg/mL |
