Ce vidéo montre comment un plasmide minigénome tétracistronique imitant le génome du virus Ebola est transfecté dans des cellules humaines en même temps que des plasmides auxiliaires. À l'intérieur des cellules, des protéines virales et la luciférase sont exprimées, conduisant à l'assemblage et à la bourgeonnement de particules pseudovirales non pathogènes mais capables de se répliquer.
Article de méthode
Production de particules pseudo-virales compétentes pour la transcription et la réplication du virus Ebola contenant un gène rapporteur
36 vues
⸱
30 septembre 2026
Dans cet article
Résumé
Protocole
1. Transfection des cellules productrices pour la production initiale de particules pseudo-virales compétentes pour la transcription et la réplication, ou trVLPs
- 24 h après le fractionnement des cellules (voir Figure 1 pour un aperçu du déroulement de l'expérience), pipeter l'ADN plasmidique (pour les quantités, voir Tableau 1) dans un cryotube stérile de 2 mL en utilisant des embouts filtrants. Ajouter 100 µL d'OptiMEM par puits à l'ADN. Vortexer brièvement une fois le mélange effectué, puis centrifuger doucement les tubes à l'aide d'une microcentrifugeuse. Si plusieurs puits doivent être transfectés avec des plasmides identiques, un mélange maître pour plusieurs puits peut être préparé.
- Vortexer brièvement le tube contenant le Transit LT1 avant utilisation. Ajouter 7,5 µL de Transit LT1 par puits à l'ADN dilué. Vortexer délicatement le mélange, en prenant soin de ne pas faire remonter le liquide dans le couvercle du cryotube, puis incuber 15 min à température ambiante.
- Mélanger doucement le complexe de transfection en aspirant et en rejetant à l’aide de la pipette. Ajouter 100 µL des complexes de transfection goutte à goutte dans chaque puits. Balancer la plaque vers l’avant/l’arrière et d’un côté à l’autre afin de répartir uniformément les complexes de transfection. Ne pas agiter la plaque en vortex car cela provoquerait une répartition inégale des complexes de transfection.
- Replacer les cellules dans l’incubateur.
- Après 24 h, retirer le surnageant des cellules. Ajouter 4 mL de DMEM (milieu de culture Eagle modifié par Dulbecco) contenant 5 % de SFB (sérum de veau fœtal), 2 mM de L-glutamine et 1x pen/strep (pénicilline/streptomycine) (DMEM5) aux cellules. Cette étape peut être réalisée simultanément pour jusqu’à 3 puits sans risque de dessiccation, à condition que les puits contiennent des échantillons identiques (dans le cas contraire, en raison de la nature auto-amplifiante des trVLPs (particules pseudovirales compétentes pour la transcription et la réplication) dans ce système, une contamination croisée pourrait survenir, et cette étape devrait alors être effectuée puits par puits).
- Replacer les cellules dans l’incubateur.
Tableau 1. Quantités d'ADN pour la transfection. La quantité de chaque plasmide nécessaire pour la transfection des cellules productrices et cibles est indiquée en ng par puits d'une plaque de 6 puits.
| Cellules productrices (p0) | Cellules cibles (p1 et supérieures) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| pCAGGS-L | 1 000 | 1 000 |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-Tim1 | - | 250 |
Résultats
Figure 1. Déroulement d'un essai de trVLP tétracistronique sur 3 passages consécutifs. Les jours correspondant à la mise en culture des cellules (s), à la transfection des cellules (t), à l'infection des cellules (i), au changement de milieu (c) et à la récolte des cellules et des trVLP (h) sont indiqués pour trois passages consécutifs (indiqués par des flèches).
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Flacon de culture cellulaire de 75 cm² | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | Préchauffer à 37 °C avant utilisation |
| FBS | Life technologies | 26140-079 | Inactiver par la chaleur pendant 30 min à 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| Plaques 6-puits | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 |
