Essai basé sur la luciférase pour évaluer des composés antiviraux dans des cellules embryonnaires rénales humaines

Résumé

Source : Lucas-Hourani, M. et.al., Analyse à haut débit de l'identification d'inhibiteurs chimiques à large spectre des virus à ARN. J. Vis. Exp. (2014)

Ce vidéo montre un dosage antiviral basé sur la luciférase dans des cellules rénales embryonnaires humaines infectées par un virus de la rougeole recombinant. Elle montre que des composés testés dilués en série inhibent la réplication virale, entraînant une luminescence réduite de manière dépendante de la dose, tout en préservant la viabilité des cellules hôtes.

Protocole

1. Préparation de cultures cellulaires infectées par le virus de la rougeole (MV) exprimant la luciférase de luciole (rMV2/Luc)

1. Cultiver les cellules HEK-293T à 37 °C et 5 % CO₂ dans le milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM) contenant du L-glutamine stabilisé et supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (FCS), de la streptomycine (100 μg/ml) et de la pénicilline (100 UI/ml). Les cellules sont repiquées par trypsination tous les 4 à 5 jours et diluées au 1:10 dans un nouveau flacon. Les cellules doivent être en phase logarithmique pour les expériences.
2. Le jour de l'expérience, récupérer les cellules par trypsination et effectuer un dénombrement cellulaire. Former un culot cellulaire par centrifugation, puis resuspendre les cellules à 3 x 10⁵ cellules/ml dans le milieu de culture. Prévoir que 12,5 ml de suspension cellulaire sont nécessaires pour chaque plaque de criblage.
3. Resuspendre à nouveau les cellules à 3 x 10⁵ cellules/ml dans le milieu de culture. Prévoir que 12,5 ml de suspension cellulaire sont nécessaires pour chaque plaque de criblage.
4. Facultatif : supplémenter le milieu de culture avec de l'uridine à 20 μg/ml.
   REMARQUE : Lors du criblage de bibliothèques chimiques à la recherche d'inhibiteurs de la réplication virale, des composés ciblant les premières étapes de la voie de biosynthèse des pyrimidines sont fréquemment isolés. L'ajout d'uridine dans le milieu de culture permet d'éliminer ces molécules antivirales. En effet, cela restaure efficacement la réplication virale lorsque les enzymes en amont de la voie de biosynthèse des pyrimidines sont bloquées.
5. Conserver 1/10 de la suspension cellulaire pour les puits témoins contenant des cellules non infectées, et procéder à l'infection avec le volume restant.
6. Dégeler le volume approprié de solution stock de rMV2/Luc. Les solutions stock de MV sont généralement à raison de 10⁶-10⁸ particules infectieuses par ml. La culture doit être infectée avec 0,1 particule infectieuse de rMV2/Luc par cellule cible, ce qui correspond à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,1. 
   REMARQUE : Le rMV2/Luc dérive du vaccin contre la rougeole (souche Schwarz) et doit être manipulé dans un environnement de niveau de biosécurité 2 (BSL2).
7. Ajouter le virus à la suspension cellulaire et mélanger délicatement. Transférer les cellules infectées dans un réservoir, puis distribuer 100 μl de suspension cellulaire infectée dans les colonnes 2 à 11 des plaques D2 contenant les composés chimiques ajoutés. La suspension cellulaire dans le réservoir est régulièrement mélangée délicatement.
8. Dans les colonnes 1 et 12, distribuer 100 μl de cellules non infectées dans chaque puit. Les cellules infectées sont distribuées dans les autres puits.
9. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 °C et 5 % CO₂.

2. Écran secondaire pour la toxicité et l'activité antivirale à large spectre

1. Effectuez des dilutions sérielles 1:2 pour chaque composé actif dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), en partant de 500 µM jusqu'à 4 µM (8 dilutions). Remplissez des plaques de culture tissulaire blanches, codées à barres, avec 50 µl de milieu de culture. Ajoutez 1 µl de chaque dilution de composé dans les puits de culture. Répétez deux fois afin d'obtenir 3 plaques de culture contenant des dilutions sérielles dupliquées pour chaque composé actif.
2. Préparez 37,5 ml d'une suspension de cellules HEK-293T à 6 x 10⁵ cellules/ml dans le milieu de culture, comme décrit précédemment (en 1.1 et 1.2). Répartissez 2 x 12,5 ml dans des tubes Falcon et infectez les cellules soit avec le rMV2/Luc à un MOI = 0,1, soit avec le virus recombinant de la chikungunya (CHIKV) exprimant la luciférase Renilla (CHIKV/Ren) à un MOI = 0,2. Mélangez par retournement.
   REMARQUE : Le CHIKV/Ren est dérivé d'une souche sauvage de CHIKV et doit donc être manipulé dans un environnement BSL3. Les plaques peuvent être transférées du BSL3 au BSL1 une fois que le substrat Renilla a été ajouté aux puits de culture (voir ci-dessous).
3. Répartissez 50 µl de cellules non infectées, infectées par rMV2/Luc ou infectées par CHIKV/Ren dans des plaques de culture contenant des dilutions sérielles des composés actifs. Incubez pendant 24 heures à 37 °C.
4. Ajoutez 50 µl de substrat de luciférase de luciole pour déterminer l'activité de la luciférase de luciole dans les puits infectés par rMV2/Luc. Ajoutez 50 µl de substrat de luciférase Renilla pour déterminer l'activité de la luciférase Renilla dans les puits infectés par CHIKV/Ren. Enfin, ajoutez 50 µl de réactif d'essai de viabilité basé sur la luciférase aux cellules non infectées afin d'évaluer la viabilité cellulaire.
5. Tracez les données (Figure 1) et déterminez les concentrations des composés actifs qui inhibent la réplication du MV et du CHIKV de 50 %. Écartez les composés présentant une certaine toxicité dans cet essai.

Résultats

Figure 1. Activité antivirale dose-dépendante et toxicité des composés C864, C648 et C062. (A) Des cellules HEK-293T ont été infectées avec la souche rMV2/Luc du virus de la rougeole exprimant la luciférase (MOI = 0,1) et incubées avec des doses croissantes de C864, C648, C062 ou du DMSO seul. Après 24 heures, l'expression de la luciférase a été déterminée. * indique que les inhibitions de la luciférase observées étaient statistiquement significatives avec les trois composés (valeurs de p < 0,05). (B) Des cellules HEK-293T ont été infectées avec la souche CHIKV/Ren du virus CHIKV exprimant la luciférase Renilla (MOI = 0,2) et incubées avec des doses croissantes de C864, C648, C062 ou du DMSO seul. Après 24 heures, l'expression de la luciférase Renilla a été déterminée. * indique des inhibitions statistiquement significatives avec les trois composés (valeurs de p < 0,05). (C) Des cellules HEK-293T ont été incubées avec des doses croissantes de C864, C648, C062 ou du DMSO seul. Comme contrôle de la toxicité, les cultures cellulaires ont été supplémentées avec 2,5 μl d'une solution à 0,5 % d'IGEPAL. Après 24 heures, le nombre de cellules vivantes a été déterminé à l'aide d'un test de viabilité basé sur la luciférase.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plateforme Freedom EVO	TECAN		Plateforme robotisée
Microplaques de culture cellulaire en polystyrène, 96 puits, blanches	Greiner Bio One	655083
Test de viabilité cellulaire luminescent CellTiter-Glo	Promega	G7570	Test de viabilité basé sur la luciférase
Système d'essai de luciférase Bright-Glo	Promega	E2610	Réactif contenant le substrat de la luciférase de luciole
Système d'essai de luciférase Renilla-Glo	Promega	E2710	Réactif contenant le substrat de la luciférase Renilla
Système d'essai de gène rapporteur Britelite plus	Perkin-Elmer	6016761	Réactif contenant le substrat de la luciférase de luciole. Peut être utilisé comme alternative au réactif Bright-Glo pour déterminer l'activité de la luciférase.