Isolation d'un virus géant unique à partir d'une population virale mixte en utilisant des amibes

Résumé

Source : Sahmi-Bounsiar, D. et al. La micro-aspiration de cellules uniques comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation de mélanges de virus géants. J. Vis. Exp. (2019)

Ce vidéo montre la micro-aspiration de cellules uniques pour isoler et amplifier une population unique de virus géants à partir d'une population virale mixte en utilisant des amibes comme cellules hôtes.

Protocole

1. Culture d'amibes

1. Utiliser Vermamoeba vermiformis (souche CDC19) comme support cellulaire.
2. Ajouter 30 mL de milieu protéase-peptone-extrait de levure-glucose (PYG) (Tableau 1) et 3 mL des amibes à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL dans un flacon de culture cellulaire de 75 cm².
3. Entretenir la culture à 28 °C.
4. Après 48 h, quantifier les amibes à l’aide de lamelles de comptage.
5. Pour le rinçage, récolter les cellules à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL et former un culot d’amibes par centrifugation à 720 x g pendant 10 min. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans le volume approprié de milieu de privation afin d’obtenir une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL (Tableau 1).

2. Dilution finale

1. Réaliser une dilution en série (10^-1 à 10^-11) de l'échantillon viral dans du milieu de privation (Tableau 1).
2. Inoculer 2 mL de 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis dans chaque boîte de Pétri avec 100 µL de l'inoculum du mélange.
3. Placer les boîtes de Pétri dans un sac plastique hermétique à 30 °C.
4. Commencer l'observation des boîtes de Pétri par microscopie optique inversée 6 h après l'infection et vérifier la morphologie cellulaire toutes les 4 à 8 heures.
5. Dès l'apparition de l'effet cytopathique caractérisé par un arrondissement des cellules, commencer le processus de micro-aspiration au niveau de la cellule unique.

3. Microaspiration de cellules uniques

1. Préparer l'hôte
   REMARQUE : Cette préparation est effectuée pour libérer des cellules individuelles infectées vers un nouveau support cellulaire.
   1. Traiter les amibes en culture avec un agent antimicrobien contenant 10 µg/mL de vancomycine, 10 µg/mL d'imipénème, 20 µg/mL de ciprofloxacine, 20 µg/mL de doxycycline et 20 µg/mL de voriconazole. Ce mélange est utilisé afin d'éviter toute contamination bactérienne et fongique.
      REMARQUE : La procédure s'effectue sur un plan de travail situé à l'extérieur de la station de sécurité microbiologique. Ajouter 2 mL d'amibes concentrées à 1 x 10⁶ cellules/mL chacun dans 15 boîtes de Pétri. Incuber la culture à 30 °C pendant 30 min afin de permettre l'adhérence des amibes.
2. Sélectionner la boîte de Pétri utilisée pour la micro-aspiration à partir de la dilution limite selon les critères suivants : 1) absence de contamination visible par des agents fongiques ou bactériens, 2) présence d'un effet cytopathique sur les amibes dû aux virus, et 3) phase prélytique et arrondissement des amibes (afin d'éviter l'aspiration de particules virales).
3. Configurer un poste de travail avec les matériaux suivants (Figure 1A,B) : Micromanipulateur, permettant le positionnement de la microcapillaire ; Dispositif manuel de contrôle de pression, utilisé pour aspirer et relâcher les cellules dans la microcapillaire ; Microscope inversé ; Modules moteur plug-and-play ; Caméra ; Module informatique pour visualiser la manipulation et prendre des images.
4. Choisir une microcapillaire (Figure 1C).
   REMARQUE : La taille des cellules, la déformation et l'adhérence de leurs membranes aux surfaces, ainsi que la motilité cellulaire peuvent influencer le bon déroulement de la micro-aspiration. Le diamètre de la microcapillaire peut être précisément choisi et adapté à des types cellulaires spécifiques selon leur taille et les méthodes d'aspiration. Une microcapillaire de 20 µm de diamètre intérieur a été utilisée pour aspirer une amibe arrondie (diamètre ~10 µm). Cela permet de maintenir une position interne stable et un relâchement facile de la cellule.
5. Monter le système.
   1. Régler l'angle d'opération du système de fixation sur le module motorisé à 45°.
   2. Effectuer une double installation, d'abord sur le système de fixation, puis sur la microcapillaire.
   3. Faire la mise au point sur les cellules après avoir fait passer quelques gouttes d'huile à travers la microcapillaire.
      REMARQUE : L'huile minérale biocompatible est fournie par l'appareil.
   4. Terminer le montage conformément aux recommandations du fabricant.
6. Cloner les cellules (Figure 2A,B)
   1. Placer la boîte de Pétri contenant 2 mL d'amibes infectées sous le microscope.
   2. Faire d'abord la mise au point sur les cellules, puis sur la microcapillaire immergée dans la culture.
   3. Sélectionner une cellule unique arrondie et rapprocher la microcapillaire du micromanipulateur.
   4. Exercer une aspiration douce à l'aide du contrôle manuel de pression sur la cellule, en l'aspirant à l'intérieur de la microcapillaire. Retirer la cellule unique de l'échantillon initial et la relâcher dans le support cellulaire, puis l'incuber à 30 °C.
   5. Effectuer des observations quotidiennes à l'aide d'un microscope optique inversé afin de suivre l'apparence des cellules et de surveiller l'apparition de l'effet cytopathique.

Tableau 1 : Composition des milieux de culture

Résultats

Figure 1 : Matériel pour la micromanipulation. (A) Installation réelle de la station de travail. (B) Illustration schématique des composants de la station de travail. (C) Illustration schématique de la microcapillaire.

Figure 2 : Étapes de la micro-aspiration. (A) Procédure d'isolement de cellules uniques (grossissement x40). (B) Illustration schématique des différentes étapes de l'aspiration de cellules uniques : 1) Localisation de la cellule. 2) Aspiration de la cellule. 3) Étape de relâchement. Les flèches noires indiquent la microcapillaire et les flèches blanches montrent la cellule unique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Flacons de culture cellulaire Corning 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
Flacons de culture cellulaire Corning 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	Culture
Flacons de culture cellulaire Corning 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	Culture
Caméra DFC 425C	LEICA	Unkown	Observation/suivi
Microscope inversé Eclipse TE2000-S	Nikon	Unkown	Observation/suivi
Microcapillaire 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiration et relâchement des cellules
Micromanipulateur InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Positionnement du microcapillaire
Boîte de Pétri 35 mm	Ibidi	81158	Culture/observation