Tri basé sur la fluorescence de particules virales individuelles pour l'analyse génomique

Résumé

Source : Zeigler Allen, L., et al. Isolement et analyse génomique de virions uniques à l'aide de la « génomique de virus unique ». J. Vis. Exp. (2013).

Ce vidéo montre comment la cytométrie en flux permet l'isolement de virus individuels contenant un génome à partir de populations mixtes, grâce à une détection basée sur la fluorescence et un tri précis des particules, suivi d'un encapsulage dans l'agarose en vue d'une caractérisation génomique ultérieure.

Protocole

1. Préparation des suspensions virales

Avant l'isolement de virions individuels par cytométrie en flux, préparez des suspensions virales non fixées.

1. Isoler les particules virales en utilisant des protocoles établis auparavant, en veillant à ce que la suspension virale finale soit contenue dans du tampon TE (Tris-EDTA, pH 8) filtré à 0,1 μm. Nous recommandons d'utiliser des approches de filtration tangentielle (TFF), bien que d'autres méthodes utilisant la floculation chimique aient été développées.
2. Compter les particules virales à l'aide de protocoles établis, par exemple par épifluorescence 8-10 ou par cytométrie en flux.
3. Aliquoter la suspension virale dans deux tubes Eppendorf (un volume final de 1 000 μl est recommandé).

2. Cytométrie en flux

1. Pour trier les virus à l'aide du cytomètre en flux BD FACSAria II équipé d'un PMT personnalisé de diffusion avant (FSC PMT), diluer les particules virales dans du tampon TE filtré sur 0,1 μm, pH 8,0, jusqu'à un titre approprié permettant un taux d'événements de 200 événements sec^-1.
2. Régler les seuils afin de maximiser les rapports signal sur bruit, par exemple, pour un assemblage mixte contenant des particules de phages T4 et lambda, les réglages suivants sont recommandés : FSC PMT à 1 000 et SSC à 200.
3. Analyser 100 μl d'échantillons « blancs » contenant uniquement 1) du tampon TE filtré sur 0,1 μm et 2) du tampon TE filtré sur 0,1 μm et du SybrGreen1 dilué à 1e-4 de la solution mère (10 000X).
4. Analyser un petit aliquot (100 μl est recommandé) de suspension virale non marquée afin d'évaluer le bruit de fond, puis la suspension virale marquée (SybrGreen1 dilué à 1e-4 de la solution mère), jusqu'à un total de 5 000 événements pour chaque échantillon. Cette étape permet de vérifier la concentration et d'ajuster, si nécessaire, les fenêtres de tri avant le tri proprement dit. Nous recommandons une fenêtre étroite centrée sur les particules virales. En outre, pour définir les fenêtres, nous utilisons le tracé SYBR Green contre FSC PMT.
5. Ajouter 5 μl d'agarose à bas point de fusion (LMP) à 1 % (dans du tampon TBE), refroidie à 37 °C, dans chaque puits d'une lame à microscope en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (Electron Microscopy Sciences).
6. Placer la lame à microscope PTFE dans le cytomètre en flux afin de capturer les particules virales triées.
7. Commencer le tri des particules virales marquées au vert SYBR directement sur la lame PTFE contenant l'agarose LMP. Nous recommandons de trier 10 événements ou plus (particules virales) dans certains puits afin de faciliter la détection de la profondeur des virus lors de la microscopie à balayage laser confocale (CSLM).
8. Lorsque le tri est terminé, retirer la lame du cytomètre en flux et ajouter 5 μl supplémentaires d'agarose LMP refroidie à 37 °C dans chaque puits, encapsulant ainsi la ou les particules virales.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon TE 1X	Invitrogen	12090-015
Phénol saturé au tampon	Invitrogen	15513-039
Agarose à bas point de fusion (LMP)	Invitrogen	16520100
Lame de microscope en PTFE	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 puits, diamètre de 4 mm
β-agarase	New England Biolabs	M0392S