Enrichissement d'échantillons d'eau environnementaux en virus géants à base d'amibes

Résumé

Source : Bou Khalil, J. Y.,et al. Une stratégie rapide pour l'isolement de nouveaux Faustovirus à partir d'échantillons environnementaux en utilisant Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)

Ce vidéo montre l'enrichissement de virus géants à partir d'un échantillon d'eau environnementale en utilisant une co-culture basée sur les amibes afin de permettre la détection et l'analyse en aval.

Protocole

1. Collecte des échantillons

1. Prélevez 70 échantillons à partir de différents environnements et régions. Dans ce cas, utilisez les échantillons suivants : 5 échantillons d'eau sale provenant du village de Saint Pierre de Meyzoargues (France), 15 échantillons provenant du lac du Parc Borély à Marseille (France) ; 15 échantillons d'eau de mer avec sédiments provenant des criques rocheuses de Samena à Marseille (France), 25 échantillons d'eau de rivière provenant des Alpes (France), et enfin, 10 échantillons d'eaux usées provenant de La Ciotat (France).
2. Vortexez les échantillons pendant une minute à température ambiante sans traitement préalable afin de les homogénéiser avant l'inoculation.

2. Procédure d'isolement

1. Préparation de l'hôte pour les procédures de culture aveugle et inoculation des échantillons
   1. Utiliser Vermamoeba vermiformis (souche CDC19) comme support cellulaire pour la co-culture.
   2. Maintenir les amibes à 28 °C, dans un flacon de culture cellulaire de 75 cm² contenant 30 ml de milieu protéase-peptone-extrait de levure-glucose (PYG). Vérifier la composition du PYG dans le Tableau 1.
      REMARQUE : Après 48 h, les amibes sont quantifiées par un dénombrement classique à l’aide de lamelles de comptage (par exemple, Kovaslides).
   3. Récupérer les cellules à une concentration de 5 x 10⁵ à 10⁶ cellules/ml, et former un culot d'amibes par centrifugation à 720 x g pendant 10 min.
   4. Éliminer le surnageant par aspiration, puis resuspendre le culot d'amibes dans 30 ml de solution saline amoebienne stérile de Page (PAS) Tableau 1. Répéter cette procédure de rinçage.
   5. Resuspendre les amibes dans 30 ml de milieu de privation contenant un mélange d'antibiotiques et d'antifongiques à une concentration d'environ 10⁶ amibes/ml. Le milieu de privation est un milieu de survie pour les amibes, leur permettant de rester vivantes sans kystisation ni multiplication. Vérifier la composition dans le Tableau 1.
      REMARQUE : Le mélange d'agents antimicrobiens contenait 10 µg/ml de vancomycine, 10 µg/ml d'imipénème, 20 µg/ml de ciprofloxacine, 20 µg/ml de doxycycline et 20 µg/ml de voriconazole. Ce mélange permettait de réduire la contamination bactérienne et fongique pouvant diminuer ou altérer la multiplication virale.
   6. Inoculer directement 25 µl de chaque échantillon sur une monocouche d'amibes de 200 µl dans une plaque à 96 puits à fond plat favorisant l'adhérence des amibes, puis incuber à 30 °C dans un environnement humide (un environnement humide consiste à placer un compressif humide à l'intérieur du sachet contenant la plaque afin d'éviter l'évaporation). Il s'agit de la primo-culture. Laisser deux puits d'amibes sans inoculation d'échantillon ; ils servent de contrôle négatif. Incuber cette primo-culture pendant trois jours.
   7. Trois jours après la première inoculation, réaliser une sous-culture de la plaque de primo-culture sur des amibes fraîches comme décrit ci-dessus, sans observation microscopique. Incuber la nouvelle plaque pendant trois jours dans les mêmes conditions que la primo-culture.
   8. Réaliser la culture finale après ces trois jours d'incubation de la même manière que pour la primo- et la sous-culture. Incuber la culture finale pendant deux jours. Puis procéder à la détection.

Tableau 1. Recettes des solutions

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu protéase-peptone-extrait de levure-glucose (PYG), solution saline amoebienne de Page (PAS), milieu de privation	Production interne de laboratoire	Marseille URMITE	x
Souche d'amibe CDC-19	ATCC	France	50237
Plaques	Cellstar	France	655180
Flacons	SARSTEDT	Allemagne	833911
Ultracentrifugeuse Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448