Ce vidéo montre le test de foyers de fluorescence utilisé pour quantifier le virus de l'hépatite C infectieux en culture cellulaire. Elle illustre la dilution sérielle du surnageant viral, l'infection de cellules d'hépatome et la détection des sites de réplication virale par microscopie de fluorescence basée sur l'utilisation d'anticorps.
Article de méthode
Quantification du virus de l'hépatite C infectieux par microscopie à fluorescence
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30 septembre 2026
Dans cet article
Résumé
Protocole
1. Mesure du titre viral
- Ensemencer des cellules Huh-7.5.1 naïves à environ 3 x 103 cellules/puits dans une plaque 96-puits. Le lendemain, effectuer des dilutions sérielles décimales du surnageant de culture sans cellules, récupéré à partir de cellules transfectées par l'ARN du virus de l'hépatite C (VHC), à l'aide du milieu de croissance, et inoculer en triplicat sur des cellules Huh-7.5.1.
- Fixer les cellules 72 heures après l'infection à l'aide de méthanol (pendant 30 min à -20 ºC) et réaliser une immunomarquage pour la protéine NS5A du VHC.
- Laver les cellules trois fois avec du PBS et bloquer avec un tampon de blocage IFA.
- Utiliser un anticorps primaire polyclonal de lapin anti-NS5A ou un anticorps monoclonal de souris anti-ARNdb J2 à une dilution de 1:200 (1 μg/ml) et incuber de 5 h à toute la nuit à 4 ºC.
- Laver les cellules trois fois avec du PBS après l'incubation avec l'anticorps primaire.
- Ajouter un anticorps secondaire polyclonal de chèvre anti-IgG de lapin marqué IgG-488 ou un anticorps secondaire polyclonal de chèvre anti-IgG de souris marqué IgG-594 à une dilution de 1:1 000 (1 μg/ml) et incuber pendant 1 h à température ambiante.
- Laver les cellules trois fois avec du PBS et observer à l'aide d'un microscope à fluorescence.
- Utiliser la dilution la plus élevée pour compter les foyers positifs pour NS5A et calculer le nombre moyen d'unités formant des foyers (FFU) par millilitre. Voir Figure 1 pour le titrage du VHC.
Résultats
Figure 1. Analyse de l'infectiosité du VHC de type sauvage et mesure du titre viral. A) Des cellules Huh-7.5.1 naïves ont été utilisées pour les études d'infection. Le surnageant acellulaire recueilli 48 et 96 heures après la transfection (hpt) de l'ARN du VHC a été soumis à des dilutions séries dix fois et ajouté aux cellules dans une plaque 96 puits en triplets. Soixante-douze heures après l'infection, les cellules ont été fixées et immunomarquées pour la protéine NS5A du VHC. Les cellules présentant une coloration positive pour NS5A (en rouge) sont infectées par le virus. Pour l'évaluation de l'unité formant des foyers (FFU), les foyers positifs à la plus forte dilution ont été comptés. Des images représentatives sont présentées (échelle : 100 μm). B) Les valeurs moyennes et les écarts-types du titre viral en unités formant des foyers (FFU) par millilitre sont indiqués sur le graphique. Le mutant nul de la polymérase n'a pas produit de particules infectieuses. WT : type sauvage ; Pol- : polymérase nulle.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | La lignée cellulaire a été gracieusement fournie par le Dr Francis Chisari au Dr Arumugaswami dans le cadre d'un accord MTA signé entre The Scripps Research Institute et le Cedars-Sinai Medical Center | |
| Anticorps monoclonal de souris anti-RNA double brin J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Anticorps secondaire polyclonal caprin anti-IgG de lapin Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Anticorps secondaire polyclonal caprin anti-IgG de lapin Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 |
