Cette vidéo illustre l'utilisation de la chimie click et de la microscopie de fluorescence pour visualiser la transcription de l'ARN néosynthétisé dans les cellules de mammifères. Elle met en évidence comment l'infection virale supprime la transcription de l'hôte en comparant les signaux fluorescents entre les cellules infectées et les cellules témoins.
Article de méthode
Visualisation de la suppression transcriptionnelle dans des cellules infectées par un virus
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30 septembre 2026
Dans cet article
Résumé
Protocole
Infecter les cellules avec la souche MP-12 du virus de la fièvre de la vallée du Rift (RVFV) et marquer l'ARN néosynthétisé avec de l'uridine 5-éthynyl (EU)
- Ensemencer des cellules de rein embryonnaire humain 293 (HEK293) dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits contenant du milieu de croissance (milieu de Dulbecco modifié (DMEM) complété avec 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine). Incuber dans une étuve humidifiée à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 à 100 %.
- Infecter les cellules avec MP-12 à une multiplicité d'infection (MOI) de 3. Inclure au moins deux puits non infectés : l'un servira de témoin non infecté, l'autre sera traité avec de l'actinomycine D (ActD). Retirer le milieu de croissance et diluer le stock viral de manière à ce que le volume total ajouté à chaque puits soit de 400 μL. Incuber pendant 1 heure dans une étuve humidifiée à 37 °C et 5 % de CO2.
- Retirer l'inoculum et ajouter 2 mL de milieu de croissance frais par puits. Incuber à 37 °C pendant 12 heures.
REMARQUE : Si ce protocole est adapté à un autre virus, il est conseillé de réaliser une expérience cinétique afin de déterminer le moment optimal pour le marquage et la récolte. Organiser cette cinétique de manière à ce que les temps d'infection soient décalés et que tous les échantillons puissent être marqués, récoltés et colorés en même temps.
- Au point temporel de 12 heures post-infection (hpi), remplacer le milieu de croissance par un milieu contenant 0,5 mM d'EU. Dans l'un des puits témoins non infectés, ajouter également 5 μg/mL d'ActD. Ce puit servira de contrôle pour la suppression de la transcription, car l'ActD inhibe la synthèse d'ARN dépendante de l'ADN. Remettre les cellules dans l'étuve.
- Au point temporel de 13 hpi, laver les cellules une fois avec du tampon phosphate salin (PBS) et les récolter par trypsination. Laver les cellules récoltées trois fois avec du PBS contenant 1 mM d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA).
REMARQUE : Pendant cette étape et les suivantes, ne pas centrifuger les cellules à plus de 500-1 000 x g afin d'éviter leur rupture. Centrifuger les cellules pendant 1 à 2 minutes pour les sédimenter.
REMARQUE : Si une immunomarquage de surface est prévu après la réaction « click », récolter les cellules à l'aide d'un racloir en caoutchouc ou d'un grattoir cellulaire jetable.
- Fixer les cellules en les resuspendant dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et incuber pendant 30 minutes à température ambiante (TA).
- Laver une fois avec 1 mL de PBS-EDTA par puits. Passer immédiatement à l'étape 2.
REMARQUE : Il est important de poursuivre immédiatement avec la réaction « click », car l'ARN se dégrade si les cellules restent trop longtemps à ce stade. De même, lors d'une expérience cinétique, veiller à marquer, fixer et colorer tous les échantillons en même temps.
Réaction « click » pour détecter l'ARN marqué
- Perméabiliser les cellules en ajoutant 1 mL de Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
REMARQUE : Toutes les solutions utilisées aux étapes 2.1 à 2.3 doivent être exemptes de nucléases.
- Laver trois fois avec 1 mL de PBS par puits.
- Retirer les lamelles d'une plaque à 12 puits et les transférer dans une chambre humide. Recouvrir chaque lamelle avec 50 à 100 μL de solution de coloration « click » (Tris 100 mM, pH 8,5, CuSO4 1 mM, azoture fluorescent 20 μM [maximum d'excitation/émission : 590/617 nm], acide ascorbique 100 mM). Incuber pendant 1 heure à température ambiante à l'abri de la lumière.
REMARQUE : Pour préparer la chambre humide, recouvrir le fond d'une boîte de Pétri ou d'une boîte de culture cellulaire de 10 cm de diamètre avec un film plastique en paraffine. Tapisser l'intérieur du bord de la boîte avec des essuie-tout humides. Placer les lamelles sur le film plastique en paraffine.
REMARQUE : Veiller à ne pas laisser les lamelles sécher pendant cette étape ou toute autre étape du protocole. Il est préférable d'ajouter la solution de coloration directement sur chaque lamelle juste après son placement dans la chambre humide.
REMARQUE : Préparer la solution de coloration « click » fraîchement juste avant cette étape. Des solutions mères de Tris 1,5 M, pH 8,5, CuSO4 100 mM et acide ascorbique 500 mM peuvent être conservées à 4 °C. Toutefois, jeter toute solution mère d'acide ascorbique qui a viré au jaune.
REMARQUE : Choisir un fluorophore compatible avec les filtres de votre microscope à fluorescence.
- Retirer les lamelles de la chambre humide et les placer dans une plaque à 12 puits propre, puis laver trois fois avec 1 mL de PBS par puits.
- Monter les lamelles en déposant une goutte (environ 15 μL) de Fluoromount-G sur une lame de microscope. Plonger la lamelle dans de l'H2O, éliminer l'excès d'H2O en touchant le bord contre un essuie-tout, puis placer la lamelle côté cellules vers le bas dans la goutte de Fluoromount-G. Laisser sécher à l'air pendant 5 minutes.
REMARQUE : Si l'imagerie est réalisée sur un microscope inversé, laisser le Fluoromount-G durcir à 4 °C toute une nuit ou fixer les lamelles sur la lame en scellant les bords avec du vernis à ongles transparent.
REMARQUE : Les lames peuvent être observées immédiatement ou conservées à 4 °C à l'abri de la lumière pendant jusqu'à une semaine.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 5-Éthynyluridine | Berry Associates | PY 7563 | Dissoudre dans du DMSO pour une solution mère à 100 mM |
| Couvre-objets rond de 12 mm | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| Actinomycine D (ActD) | Sigma | 9415 | Dissoudre dans du DMSO pour une solution mère à 10 mM |
| Microscope à fluorescence | par exemple Olympus IX71 | ||
| CuSO₄ | Sigma | C-8027 | Dissoudre dans H₂O pour une solution mère à 100 mM |
| DMEM (milieu Eagle modifié de Dulbecco) | Invitrogen | 11965092 | |
| SFS (sérum de veau foetal) | Invitrogen | 16000044 | |
| Azide fluorescent (conjugué à Alexa Fluor 594) | Invitrogen | A10270 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Acide L-ascorbique | Sigma | A-5960 | Dissoudre dans H₂O pour une concentration de 500 mM |
| Paraformaldéhyde | Sigma | 158127 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Invitrogen | 15140122 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trypsine-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Base de Trizma | Sigma | T-1503 | dissoudre dans H₂O pour une solution mère à 1,5 M, pH 8,5 |
