Analyse de la suppression transcriptionnelle de l'hôte induite par un virus par cytométrie en flux

Résumé

Source : Kalveram, B., et al. Utilisation de la chimie click pour mesurer l'effet de l'infection virale sur la synthèse de l'ARN des cellules hôtes. J. Vis. Exp. (2013)

Ce vidéo illustre l'utilisation de la chimie click et de la cytométrie en flux pour mesurer la suppression de la transcription cellulaire induite par un virus. Des cellules de mammifères sont infectées par un virus exprimant une protéine de virulence nucléaire qui perturbe le complexe du facteur de transcription de l'hôte, tandis que les cellules témoins restent actives sur le plan transcriptionnel. L'incorporation d'uridine 5-éthynyl marque les ARNm nouvellement synthétisés, permettant ainsi la quantification de l'activité transcriptionnelle dans les cellules infectées et les cellules témoins par détection de fluorescence double.

Protocole

1. Infecter les cellules avec le MP-12 et marquer l'ARN néosynthétisé avec de l'uridine-5-éthynyl (EU)

1. Ensemencer des cellules 293 dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits contenant du milieu de croissance (DMEM complété avec 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine). Incuber dans une étuve humidifiée à 37 °C et 5 % CO₂ jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 à 100 %.
2. Infecter les cellules avec le virus MP-12 à un i.o. de 3. Prévoir au moins deux puits non infectés : l'un servira de témoin non infecté, l'autre sera traité avec de l'ActD à l'étape 1.4. Retirer le milieu de croissance et diluer le stock viral de manière à ce que le volume total ajouté à chaque puits soit de 400 μl. Incuber pendant 1 heure dans une étuve humidifiée à 37 °C et 5 % CO₂.
3. Retirer l'inoculum et ajouter 2 ml de milieu de croissance frais par puits. Incuber à 37 °C pendant 12 heures.

REMARQUE : Si vous adaptez ce protocole à un autre virus, il est conseillé de réaliser une expérience cinétique afin de déterminer le moment optimal pour le marquage et la récolte. Organisez cette cinétique de manière à ce que les temps d'infection soient décalés et que tous les échantillons puissent être marqués, récoltés et colorés en même temps.

4. Au bout de 12 h.p.i., remplacer le milieu de croissance par un milieu contenant 0,5 mM d'EU. Ajouter également 5 μg/ml d'ActD à l'un des puits témoins non infectés. Ce puit servira de contrôle pour la suppression de la transcription, car l'ActD inhibe la synthèse d'ARN dépendante de l'ADN. Remettre les cellules dans l'incubateur.
5. Au bout de 13 h.p.i., laver les cellules une fois avec du PBS et les récolter par trypsination. Laver les cellules récoltées trois fois avec du PBS contenant 1 mM d'EDTA (PBS-EDTA).

REMARQUE : Pendant cette étape et les étapes suivantes, ne pas centrifuger les cellules à une vitesse supérieure à 500 - 1 000 x g afin d'éviter la rupture des cellules. Centrifuger les cellules pendant 1 à 2 min pour les sédimenter.

REMARQUE : Si une immunomarquage de surface est prévu après la réaction de clic, récoltez les cellules à l’aide d’un racloir en caoutchouc ou d’un racloir cellulaire jetable.

6. Fixer les cellules en les resuspendant dans 1 ml de PFA à 4 % et incuber pendant 30 min à température ambiante.
7. Laver une fois avec 1 ml de PBS-EDTA par puits. Passer immédiatement à l'étape 6.

REMARQUE : Il est important de procéder immédiatement à la réaction de « click », car l'ARN se dégrade s'il est conservé à ce stade pendant de longues périodes. De même, si vous réalisez une expérience cinétique, veillez à marquer, fixer et colorer tous les échantillons en même temps.

2. Réaction « click » pour détecter l'ARN marqué

1. Perméabiliser les cellules en les resuspendant dans 0,5 ml de Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS. Incuber 10 min à température ambiante.

REMARQUE : Toutes les solutions utilisées aux étapes 2.1 à 2.3 doivent être exemptes de nucléases. Si les cellules ne sédimentent pas correctement durant cette étape, augmentez le temps de centrifugation à 5 min. Le comportement de sédimentation s'améliorera une fois les cellules suspendues dans le tampon FACS.

2. Laver une fois avec 1 ml de PBS.

REMARQUE : N'utilisez pas d'EDTA lors de cette étape, car cela chélerait les ions Cu²⁺ nécessaires à la réaction de click.

3. Resuspendre les cellules dans 200 μl de solution de marquage par chimie click (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 200 nM d'azoture marqué avec un colorant fluorescent [maximum d'excitation/émission : 650/665 nm], 100 mM d'acide ascorbique). Incuber pendant 1 h à température ambiante à l'abri de la lumière.

REMARQUE : Préparez la solution de marquage « click » fraîchement juste avant cette étape. Les solutions mères de Tris 1,5 M à pH 8,5, de CuSO₄ 100 mM et d'acide ascorbique 500 mM peuvent être conservées à 4 °C. Toutefois, jetez toute solution mère d'acide ascorbique qui a viré au jaune. Si les cellules s'agglomèrent pendant cette étape, redisperser en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Veillez à choisir un fluorophore détectable par votre cytomètre en flux. Préparez également un échantillon de cellules infectées non soumis à la procédure de marquage « click » ; ceux-ci seront nécessaires pour l'étalonnage du cytomètre en flux. Utilisez soit la moitié des cellules infectées, soit incluez une puits supplémentaire infecté à l'étape 1.2.

Laver deux fois avec le tampon FACS (PBS contenant 1 mM de EDTA et 0,5 % (p/v) de BSA).

3. Immunofluorescence pour détecter l'expression des protéines virales

1. Resuspendre les cellules dans 200 μl d'anticorps primaire (anti-RVFV) dilué dans du tampon FACS (1:10 000) et incuber pendant 1 h à température ambiante à l'abri de la lumière.

REMARQUE : Cette étape peut également être effectuée toute la nuit à 4 °C à l'abri de la lumière.

REMARQUE : Préparez également un échantillon de cellules non infectées ayant subi la procédure de marquage par click chemistry mais qui ne seront pas immunomarquées ; ces échantillons seront nécessaires pour l'étalonnage du cytomètre en flux. Utilisez soit la moitié des cellules témoins non infectées, soit incluez une puits supplémentaire non infecté à l'étape 1.2.

REMARQUE : Lorsque vous adaptez ce protocole à l'utilisation avec un virus différent, déterminez d'abord la dilution optimale de votre anticorps primaire.

2. Laver les cellules deux fois dans le tampon FACS.
3. Resuspendre les cellules dans 200 μl d'anticorps secondaire (anti-IgG de souris conjugué à un colorant fluorescent [maximum d'excitation/émission : 495/519 nm]) dilué dans le tampon FACS (1:1 000) et incuber pendant 1 h à température ambiante à l'abri de la lumière.
4. Laver les cellules une fois dans le tampon FACS.

REMARQUE : À ce stade, les cellules peuvent être conservées O/N à 4 °C à l'abri de la lumière.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	dissoudre dans du DMSO pour une solution mère à 100 mM
couvercles ronds de 12 mm	Fisherbrand	12-545-82
tubes en polystyrène de 5 ml	BD Biosciences	352058
Actinomycine D (ActD)	Sigma	9415	dissoudre dans du DMSO pour une solution mère à 10 mM
Alexa Fluor 488 anti-IgG de chèvre	Invitrogen	A-11029
albumine sérique de bovin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	dissoudre dans H2O pour une solution mère à 100 mM
DAPI	Sigma	D-9542	dissoudre dans H2O pour une solution mère à 5 mg/ml
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
azide fluorescent (conjugué à Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
azide fluorescent (conjugué à Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
acide L-ascorbique	Sigma	A-5960	dissoudre dans H2O pour une concentration de 500 mM
filtre en papier	VWRbrand	28333-087
paraformaldéhyde	Sigma	158127
Pénicilline-Streptomycine	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (PM ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
base Trizma	Sigma	T-1503	dissoudre dans H2O pour une solution mère à 1,5 M, pH 8,5
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25200056
Microscope à fluorescence			par exemple Olympus IX71
Cytomètre en flux			par exemple BD Biosciences LSRII Fortessa