Production de particules rétrovirales pour le transfert de gènes

Résumé

Source : Zjablovskaja, P., et al., Prolifération et différenciation de cellules précurseurs myéloïdes murines 32D/G-CSF-R. J. Vis. Exp. (2018)

Ce vidéo montre la production de particules rétrovirales recombinantes par transfection de cellules d'emballage dérivées du rein humain, permettant une livraison stable de gènes vers des cellules cibles pour des applications ultérieures telles que la modification génétique, les tests fonctionnels ou les études de différenciation lignagère.

Protocole

1. Production de rétrovirus
   1. Ensemencer une suspension monocellulaire de cellules Bosc23 (6 × 10⁶) dans une boîte de Pétri de 16 cm et cultiver dans 18 mL de DMEM (milieu de Dulbecco modifié de Eagle) contenant 10 % de FBS (sérum de veau fœtal) jusqu'à ce que la confluence de la culture atteigne 80 % (24 h).
      REMARQUE : Les cellules doivent croître en monocouche et ne pas former d'agrégats en culture. Le comptage cellulaire peut être effectué selon différentes méthodes (valable pour l'ensemble des protocoles présentés ici). En cas d'un faible nombre d'échantillons, un comptage manuel au microscope à l'aide d'une chambre de Bürker est recommandé. Dans ce cas, utiliser le bleu de trypan pour l'exclusion des cellules mortes. Mélanger les cellules au ratio 1:1 avec du bleu de trypan 0,4 % dans du PBS (tampon phosphate salin). Pour effectuer le comptage d'un grand nombre d'échantillons, un compteur cellulaire automatique peut être utilisé.
   2. Combiner 40 µg de vecteur rétroviral (tel que MSCV), 20 µg de pCL-Eco (vecteur d'emballage), 80 µl de PEI (polyéthylénimine) et 2 mL de milieu à faible teneur en sérum (par exemple Opti-MEM (milieu minimum essentiel)) (sans antibiotiques). Incuber ce mélange pendant 20 min à température ambiante (TA).
   3. Remplacer soigneusement le milieu des cellules Bosc23 par 16 mL de DMEM supplémenté de 2 % de FBS. Préchauffer le milieu à 37 °C avant utilisation.
      REMARQUE : Ne pas utiliser d'antibiotiques pendant la transfection, car ils pourraient réduire l'efficacité de la transfection.
   4. Ajouter goutte à goutte et soigneusement le mélange préparé à l'étape 1.2 dans la culture de cellules Bosc23, puis incuber pendant 4 h à 37 °C. Limiter l'incubation à moins de 6 h en raison de la toxicité du PEI.
   5. Après incubation, remplacer le milieu des cellules Bosc23 par 18 mL de DMEM préchauffé contenant 10 % de FBS, et cultiver les cellules pendant 48 h à 37 °C. Placer les boîtes dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2 et respecter les procédures de sécurité standard.
   6. Recueillir le milieu des cellules Bosc23 (contenant des particules rétrovirales écotropes) à l'aide d'une pipette serologique de 25 mL dans un tube conique de 50 mL, et stocker à 4 °C.
      REMARQUE : (Important) L'efficacité de transfection devrait atteindre 90 % afin de produire un virus à haut titre.
   7. Ajouter 18 mL de DMEM préchauffé contenant 10 % de FBS aux cellules Bosc23 et cultiver pendant 24 h.
   8. Répéter l'étape 1.6.
      REMARQUE : Les surnageants rétroviraux des étapes 1.6 et 1.8 peuvent être regroupés une fois qu'ils ont atteint la même température (4 °C) afin de préserver l'intégrité virale.
   9. Pour éviter la contamination par les cellules Bosc23 dans les surnageants viraux, centrifuger le virus recueilli à 1500 × g pendant 10 min à 4 °C. Aliquoter le virus, le congeler rapidement à l'aide de glace sèche ou d'azote liquide, puis le stocker à -80 °C. Toutefois, noter que le virus fraîchement préparé présente une qualité supérieure en termes d'efficacité d'infection par rapport aux stocks congelés.
      REMARQUE : (Important) Éviter les cycles répétés de congélation/décongélation du virus, car cela entraîne sa dégradation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM ((Minimum Essential Medium) - Milieu à faible teneur en sérum	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	L-Glutamine, Rouge de phénol
Sérum de veau fœtal (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	Utilisé pour la culture des cellules HEK293T, NIH3T3 et BOSC23
Pénicilline	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
Streptomycine	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	Poudre de sulfate de streptomycine
Gentamicine	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
Polyéthylènimine	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	Linéaire, MM 25 000 (PEI 25000)