Génération du virus respiratoire syncytial recombinant marqué à la GFP à l'aide d'un système d'expression T7

Résumé

Source : Bouillier, C. et. al., Amplification et titrage de virus respiratoires syncytiaux recombinants. J. Vis. Exp. (2019)

Ce vidéo montre la génération d'un virus respiratoire syncytial recombinant exprimant la protéine verte fluorescente (GFP) à l'aide d'un système de génétique inverse basé sur T7. La co-transfection de plasmides codant pour des protéines virales et d'un génome marqué par la GFP conduit à l'expression des protéines et initie le sauvetage du virus.

Protocole

1. Récupération et premier passage du virus recombinant

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes dans un environnement stérile, en utilisant une hotte de sécurité de classe II.

1. La veille de la transfection, préparer une suspension de la lignée cellulaire BSRT7/5 à 5 x 10⁵ cellules/mL dans un milieu complet. Répartir 2 mL de suspension cellulaire par puits dans une plaque de 6 puits. Préparer un puits par virus à isoler et un puits supplémentaire pour un contrôle négatif. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % CO₂. Vérifier que les cellules présentent une confluence de 80 à 90 % le lendemain.
2. Dégeler les vecteurs viraux de génétique inverse du virus respiratoire syncytial (RSV) p-RSV-GFP et p-RSV-M2-1-GFP, ainsi que les vecteurs p-N, p-P, p-L et p-M2-1. Mélanger, pour chaque virus à isoler, 1 µg de p-N et de p-P, 0,5 µg de p-L, 0,25 µg de p-M2-1 et 1,25 µg de p-RSV (GFP ou M2-1 GFP) dans un tube.
   REMARQUE : Différents vecteurs d'expression pour les protéines virales du complexe polymérase (N, P, L et M2-1) peuvent être utilisés ; toutefois, le ratio entre les protéines doit être maintenu. Réaliser le contrôle négatif en remplaçant le vecteur p-RSV par un vecteur vide.
3. Procéder à la transfection (voir tableau des matériaux).
   1. Ajouter 250 µL de milieu à faible teneur en sérum aux vecteurs mélangés. Dans un autre tube, diluer 10 µL du réactif de transfection dans 250 µL de milieu à faible teneur en sérum. Vortexer doucement les deux tubes et attendre 5 min. Mélanger le contenu des deux tubes et attendre 20 min à température ambiante.
   2. Rincer les cellules BSRT7/5 avec 1 mL de milieu à faible teneur en sérum et répartir 1,5 mL de milieu essentiel minimum (MEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) sans antibiotiques par puits. Si nécessaire, incuber à 37 °C et 5 % CO₂ jusqu'à la fin de l'incubation décrite à l'étape 1.3.1.
   3. Ajouter 500 µL du mélange de transfection préparé à l'étape 1.3.1 dans un puits lorsque les 20 min d'incubation sont écoulées. Placer les cellules dans l'incubateur à 37 °C et 5 % CO₂ pendant 3 jours. Ne pas changer le milieu de culture des cellules pendant la transfection.
4. Observer la fluorescence de la protéine fluorescente verte (GFP) (excitation à 488 nm et émission à 515–535 nm) au microscope à fluorescence inversé avec un objectif 20x, une fois par jour, pour suivre l'efficacité de l'isolement, en utilisant le filtre GFP.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BSRT7/5		non disponible dans le commerce	Voir référence 22. Buchholz et al. 1999
Microscope à fluorescence pour observations	Olympus	IX73 Olympus microscope
Microscope à fluorescence pour la vidéomicroscopie	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99,5 %	Sigma	H3375
L-Glutamine (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
Réactif Lipofactamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	Le protocole à l'étape 2.3. est optimisé pour ce réactif.
MEM (10x), sans glutamine	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, supplément GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99,5 %	Sigma	M7506
Opti-MEM I, milieu à faible teneur en sérum	ThermoFisher Scientific	51985-026
Plasmides		non disponibles dans le commerce	Voir référence 21. Rameix-Welti et al. 2014