Essai de titrage par plages pour la quantification du virus respiratoire syncytial infectieux

Résumé

Source : Bouillier, C., et al. Production, amplification et titrage de virus respiratoires syncytiaux recombinants. J. Vis. Exp. (2019)

La vidéo démontre un essai de titrage par plaques utilisé pour quantifier le virus respiratoire syncytial recombinant (VRS) infectieux dans des monocouches de cellules épithéliales. Elle présente l'infection des cellules hôtes à l'aide de suspensions virales diluées en série, la limitation de la propagation virale par une couche semi-solide à base de cellulose, ainsi que la formation de plaques localisées résultant des effets cytopathogènes. La procédure se termine par une coloration, une décontamination et un décompte des plaques afin de déterminer le titre viral et d'évaluer l'infectiosité du VRS.

Protocole

1. Dosage par méthode des plaques

1. Préparer les plaques de 12 puits pour le titrage la veille de la réalisation du dosage (six puits seront nécessaires pour titrer un tube de virus). Ensemencer les puits avec 1 mL de cellules épithéliales humaines de type 2 (HEp-2) à 5 × 10⁵ cellules/mL. × 10⁵ cellules/mL en milieu complet.
2. Le lendemain, préparer une suspension stérile de cellulose microcristalline (2,4 % [p/v] dans l'eau) (voir tableau des matériaux).
   1. Disperser 2,4 g de poudre de cellulose microcristalline dans 100 mL d'eau distillée, à l'aide d'un agitateur magnétique standard, jusqu'à dissolution complète de la poudre (généralement 4 à 12 h). Stériliser la suspension en autoclave à 121 °C pendant 20 min et le conserver à température ambiante avant utilisation.
      REMARQUE : Dans de telles conditions, la suspension est stable pendant 1 an.
   2. Après avoir ouvert la solution dans un environnement stérile, la conserver à 4 °C pendant 6 mois. Toujours mélanger la suspension avant utilisation (par agitation manuelle ou au vortex) afin de s'assurer qu'elle est homogène.
3. Préparer le 2× milieu essentiel minimum (MEM) dans un environnement stérile. Diluer le MEM commercial 10× avec de l'eau stérile et ajouter du L-glutamine, de la pénicilline à 1 000 unités/mL et de la streptomycine à 1 mg/mL. Agiter vigoureusement la dilution et la conserver à 4 °C.
   REMARQUE : Effectuer les étapes 1.4 à 1.10 dans un environnement stérile en utilisant une hotte de sécurité de classe II.
4. Préparer six tubes contenant 900 µL de MEM sans sérum de veau fœtal (SVF) par virus à titrer (tubes de titrage). Décongeler les aliquotes de virus, les vortexer vigoureusement pendant 5 s, puis les transférer 100 µL au premier tube de titrage.
5. Effectuer une dilution au dixième 6×, comme suit. Ajouter 100 μL de virus à 900 μL du milieu dans le premier tube, mettre le bouchon sur le tube et mélanger le contenu par vortex pendant quelques secondes. Changer la pointe sur la pipette, ajouter 100 µL de la première dilution à 900 µL du milieu dans le deuxième tube, mettre le bouchon sur le tube et vortexer. Répéter la procédure jusqu'au sixième tube.
   REMARQUE : Il est très important de changer la pipette pour chaque dilution.
6. Écrire le nom du virus et les dilutions sérielles sur les plaques de 12 puits HEp-2. Ajouter une marque permettant d’associer chaque plaque à son couvercle, car ils peuvent être séparés lors de la coloration (étape 1.9). Retirer le milieu des plaques et répartir 400 µL d'une dilution par puits. Incuber les plaques à 37 °C pendant 2 h, pour l'adsorption du virus.
   REMARQUE : Changer la pipette entre chaque inoculum ou procéder d'une concentration la plus faible à la plus élevée avec la même pipette. Inoculer un nombre limité de plaques (1 à 2) simultanément afin d'éviter le dessèchement des cellules.
7. Préparer la couche de recouvrement en cellulose microcristalline pendant l'adsorption du virus (préparation extemporanée). Pour obtenir 100 mL de couche de recouvrement, mélanger 10 mL de suspension de cellulose microcristalline à 2,4 %, 10 mL de 2× MEM, et 80 mL de MEM avec 2 % de SFC.
   1. Ajuster le pH de 2× Régler le pH du MEM à environ 7,2 à l’aide d’une solution stérile de bicarbonate de sodium à 7,5 %, en se basant sur l’indicateur colorimétrique. Ajouter la suspension de cellulose microcristalline au MEM et mélanger vigoureusement.
8. À la fin de l'incubation de 2 h, ajouter 2 à 3 mL de milieu de recouvrement dans chaque puits des plaques 12 puits sans retirer l'inoculum. Veiller à éviter toute contamination des puits adjacents par des inoculums à teneur virale élevée. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 6 jours. Ne pas déplacer la plaque ni le bloc pendant l'incubation.
9. Procédez au coloration des cellules à l'aide d'une solution de violet de crésyl (8 % de violet de crésyl [v/v], 2 % de formaldéhyde [v/v] et 20 % d'éthanol [v/v] dans l'eau).
   1. Protéger la surface de travail de la cabine de sécurité biologique avec une feuille (le violet de crésyl colore fortement les surfaces).
   2. Secouer doucement les plaques pour retirer la couche de cellulose microcristalline. Éliminer les surnageants et laver les cellules 2 fois× avec 1× soluté tamponné au phosphate (PBS). Manipuler les plaques une par une afin d'éviter le dessèchement des cellules. Ajouter 1 à 2 mL de la solution de violet de crésyl et laisser agir 10 à 15 minutes. Éliminer la solution, qui peut être réutilisée pour la coloration de plaques ultérieures.
   3. Immersez les boîtes et leurs couvercles dans de l'eau de Javel fraîche pendant quelques secondes, puis rincez-les soigneusement à l'eau du robinet. Remarquez que les boîtes et les couvercles sont désinfectés par l'eau de Javel.
   4. Placer les plaques et leurs couvercles sur des essuie-tout et les laisser sécher. Sécher les plaques à température ambiante après le rinçage à l'eau et les conserver à température ambiante. Pour un stockage prolongé (plusieurs mois), protéger les plaques de la lumière afin de préserver la couleur. Remarque : si les cellules perdent leur coloration, elles peuvent être re-colorées avec du violet de crésyl.
10. Calculer les titres viraux. Compter les plaques dans les puits des plaques sèches, visibles à l'œil nu. Vérifier que le nombre de plaques des différentes dilutions est cohérent (facteur 10 entre chaque dilution). Choisir le puits sur lequel les plaques sont les plus faciles à compter. Déterminer le nombre de plaques en fonction du volume d'inoculum et de la dilution.
    REMARQUE : Dans l'exemple fourni dans Figure 1, 21 plaques sont comptées au dilution 10^-5 dilution. Ce qui correspond à un titre de

Résultats

Figure 1 : Détermination du titre de RSV à l'aide du test de plaque. (A) Résultats du test de titrage par plaques dans une plaque de 12 puits. Les six puits infectés avec des dilutions sérielles d'un stock viral sont montrés. Les dilutions sont indiquées selon un logarithme en base 10. Toutes les cellules infectées par les trois premières dilutions sont détachées. Les nombres de plaques observés avec les dilutions 10^-4, 10^-5 et 10^-6 sont cohérents. (B) Illustration du dénombrement des plaques (nombres jaunes). L'étoile verte indique des rayures sur la couche cellulaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution de violet de crésyl	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), sans glutamine	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, supplément GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
Solution de bicarbonate de sodium à 7,5 %	ThermoFisher Scientific	25080094
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122