Évaluation de la capacité de réplication virale à l'aide d'un essai de transcriptase inverse radiomarquée

Résumé

Source : Claiborne, D. T. et al. Une méthode de clonage basée sur les enzymes de restriction pour évaluer la capacité de réplication in vitro des virus chimériques de sous-type C du VIH-1 Gag-MJ4. J. Vis. Exp. (2014)

Ce vidéo montre l'évaluation de la capacité de réplication virale à l'aide d'un dosage de la transcriptase inverse radiomarquée. Des surnageants de culture contenant des virions progéniteurs sont ajoutés à un mélange de transcription inverse contenant un nucléotide radiomarqué. Le signal incorporé reflète le rendement viral et l'efficacité de la réplication. L'imagerie par phosphorélation est utilisée pour détecter et comparer les signaux entre les échantillons testés et les échantillons de type sauvage.

Protocole

1. Analyse de la transcriptase inverse (RT) dans les surnageants de culture cellulaire

1. Installer une hotte de sécurité biologique dans une installation de niveau de sécurité biologique 3 (BSL-3) pour une utilisation avec des matières radioactives.
   1. Placer du papier absorbant dans la hotte et remplacer l'aspirateur par un aspirateur désigné pour un usage radioactif. 
      REMARQUE : Tous les déchets radioactifs doivent être éliminés correctement conformément aux réglementations de sécurité.
2. Ajouter 1-2 µl de [α-³³P] désoxythymidine triphosphate (dTTP) à 10 mCi/ml et 4 µl de dithiothréitol (DTT) à 1 M à chaque aliquot de 1 ml de mélange maître de RT (voir Tableau 1).
3. Mélanger soigneusement chaque tube de microcentrifugation de 1,5 ml contenant le mélange maître de RT, le DTT et le [α-³³P] dTTP à l’aide d’une pipette de 1 000 µl, puis transférer dans un réservoir stérile.
4. Distribuer 25 µl du mélange de RT marqué dans chaque puits d'une plaque de réaction en chaîne par polymérase (PCR) à 96 puits à parois minces. 
   REMARQUE : Prévoir de l’espace pour un contrôle positif (infection par MJ4 de type sauvage (WT)) et un contrôle négatif (infection factice).
5. Ajouter 5 µl de chaque surnageant à la plaque PCR contenant le mélange maître de RT.
6. Fermer hermétiquement la plaque PCR avec un couvercle en feuille adhésive et incuber pendant 2 h à 37 °C dans un thermocycleur. Pour des raisons de sécurité, rincer les embouts de pipette avec Amphyl et jeter les embouts dans un petit contenant contenant des déchets Amphyl, qui seront ensuite éliminés comme déchets radioactifs.
7. Après l’incubation, percer de petits trous dans le couvercle en feuille à l’aide d’une pipette multicanal de 200 µl. 
   REMARQUE : Si les embouts de pipette touchent le liquide dans le puits, remplacer les embouts avant de passer à la colonne ou à la rangée suivante.
8. Mélanger les échantillons 5 fois et transférer 5 µl de chaque échantillon sur du papier DE-81. Laisser sécher à l’air pendant 10 min.
9. Laver les transferts 5 fois avec du tampon citrate de sodium-saline 1x (SSC), puis 2 fois avec de l’éthanol à 90 %, pendant 5 min par lavage. Laisser sécher à l’air.
   1. Placer chaque transfert dans un récipient de lavage séparé, par exemple une boîte de rangement pour sandwich, ajouter suffisamment de tampon de lavage (SSC 1x ou éthanol à 90 % (EtOH)) pour recouvrir le transfert, et agiter pendant 5 min.
   2. Éliminer le tampon de lavage dans un contenant séparé et répéter l’opération. REMARQUE : Les trois premiers lavages sont considérés comme radioactifs et doivent être éliminés correctement. Les deux derniers lavages peuvent être éliminés de manière habituelle.
10. Une fois secs, envelopper soigneusement chaque transfert dans du film plastique Saran et exposer à un écran phosphorescent dans une cassette hermétiquement fermée toute la nuit à température ambiante.
11. Analyser les écrans phosphorescents à l’aide d’un phosphorimager et quantifier les transcrits radioactifs.
12. Dessiner un cercle autour de chaque signal radioactif à l’aide du logiciel OptiQuant. Tracer les valeurs d’unités de lumière numérique (DLU) pour générer des courbes de réplication.
13. Pour obtenir les scores de capacité de réplication, les valeurs DLU ont été transformées en log₁₀, et les pentes ont été calculées à l’aide des points temporels des jours 2, 4 et 6. Les pentes de réplication ont ensuite été divisées par la pente du MJ4 de type sauvage (WT) afin de générer les scores de capacité de réplication. Il est important de normaliser par rapport aux valeurs WT MJ4 obtenues à partir de la même plaque RT afin de réduire la variabilité intra-test.

Tableau 1 : Recette du mélange maître pour le dosage de la transcriptase inverse radiomarquée.
REMARQUE : Conserver en aliquots de 1 ml à -20 °C.

Réactif	Volume (ml)
H2O sans nucléase	419.5
Tris-Cl, pH 7.8 (1 M)	30
Chlorure de potassium (1 M)	37.5
Chlorure de magnésium (1 M)	2.5
Nonidet P-40 (10 %)	5
EDTA (0,5 M)	1,02
Acide polyadénylique, sel de potassium (2 mg/ml)	1,25
Amorce oligo-dT (25 μg/ml)	3,25
Volume total	500

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs pour culture cellulaire
Amphyl, désinfectant/nettoyant	Fisher	22-030-394
Bacs réservoirs pour multicanal, 55 ml	Fisher	13-681-501
Solution de chlorure de magnésium 1 M	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
Réactifs pour dosage de quantification de la transcriptase inverse
dTTP, [α-³³P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
Tris-Cl 1 M, pH 8,0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	Doit être ajusté à pH 7,8 avec du KOH
Chlorure de potassium (KCl) 2 M	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	Ajuster à une solution 1 M
EDTA 0,5 M	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
Acide polyadénylique (Poly rA), sel de potassium	Midland Reagent Co.	P-3001
Amorce oligo d(T)	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Dithiothréitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
SR, écran phosphorescent haute résolution, petit format	Perkin-Elmer	7001485
Plaque Corning Costar Thermowell 96 puits, modèle (M), en polycarbonate	Fisher	07-200-245	Fabriquée par Corning Life
Bandes d'étanchéité en aluminium pour microplaque 96 puits Corning, non stériles	Fisher	07-200-684	Fabriquée par Corning Life
Papier échangeur d'anions DE-81	Whatman	3658-915
Citrate de trisodium dihydraté	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Chlorure de sodium	Fisher	S671-3
Cassette d'autoradiographie	Fisher	FB-CA-810
Écran phosphorescent de stockage Cyclone	Packard
Thermocycleur, PTC-200	MJ Research