Préparation des échantillons pour la quantification virale basée sur la luciférase

Résumé

Source : Garcia, V., et al. Titration à haut débit de virus recombinants exprimant la luciférase. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

Ce vidéo montre la préparation d'échantillons de culture cellulaire pour évaluer la charge virale à l'aide d'un dosage basé sur la luciférase. Elle décrit le processus d'infection de cellules épithéliales avec un virus génétiquement modifié, le transfert de surnageants viraux et d'étalons dans des puits de dosage, et la promotion de l'entrée virale par centrifugation et incubation. L'expression de la luciférase sert de marqueur, permettant la quantification de la concentration virale en fonction du signal luminescent émis.

Protocole

1. Préparation des échantillons

1. Obtenez des échantillons contenant un virus exprimant la luciférase (dans ce cas, VSV∆51-Fluc à titre d'exemple) pour la titration et transférez-les dans des plaques de 96 puits. En alternative, effectuez des infections dans des plaques de culture tissulaire de 96 puits et utilisez directement les surnageants.
2. Laissez deux colonnes non traitées afin d'inclure des courbes standards. Pour les expériences réalisées directement dans des plaques de 96 puits, effectuez le titrage à la fin de l'expérience (40 heures post-infection) ou conservez les échantillons à -80 °C et effectuez le titrage ultérieurement.

2. Préparation des cellules perméables pour la titration du virus

1. 24 heures avant le titrage, préparer une suspension de cellules Vero à une concentration de 2,5 x 10⁵ cellules/ml dans un milieu de culture Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 30 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) et 1 % de pénicilline/streptomycine. 
   REMARQUE : Bien que ce protocole utilise des cellules Vero, toute lignée cellulaire perméable appropriée pour l’infection par le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) pourrait être utilisée.
2. Ensemencer 2,5 x 10⁴ cellules (100 μl) dans des plaques blanches plates à fond plat à 96 puits à l’aide d’un distributeur de microplaque.
   1. Préparer 12 ml de suspension cellulaire par plaque, plus 5 ml pour l’amorçage.
   2. Nettoyer la cassette du distributeur de microplaque en rinçant les tubulures avec 50 ml d’eau stérile.
   3. Remplir les lignes du distributeur de microplaque avec la suspension cellulaire et laisser s’écouler 5 ml de suspension cellulaire.
   4. Sélectionner un programme qui distribuera 100 μl dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à parois blanches. Distribuer, et répéter selon les besoins pour les plaques supplémentaires. En outre, ensemencer quelques puits dans une plaque claire plate à fond plat à 96 puits si des plaques à fond opaque à parois blanches sont utilisées pour vérifier la santé et la densité des cellules.
   5. Une fois terminé, repousser les cellules dans le récipient d’origine. Nettoyer la cassette en faisant circuler 50 ml d’éthanol à 70 %, suivi de 50 ml d’eau stérile tiède à travers les tubulures.
   6. S’assurer que la cassette et les tubulures sont correctement nettoyées entre chaque utilisation.
3. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂.

3. Préparation de la courbe standard virale

1. Préparer une courbe standard de VSV∆51-Fluc dans du DMEM sans sérum de manière à ce que la concentration finale d'unités formant des plaques (pfu) par ml après transfert sur les cellules Vero soit la suivante : 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml et 10¹ pfu/ml. Préparer 50 μl de chaque concentration par plaque de cellules Vero, plus 10 % supplémentaires.
   REMARQUE : Le titre de la souche virale exprimant la luciférase devra être évalué selon une méthode classique afin de générer une courbe standard permettant une quantification absolue. Sinon, une quantification relative peut être obtenue sans information précise sur le titre, en fixant arbitrairement le titre viral selon les étapes de dilution. Par exemple, la première dilution de la courbe standard peut être fixée à 10⁸ unités virales, la dilution suivante au 1/10 à 10⁷, et ainsi de suite. Dans ce cas, les valeurs doivent être exprimées en tant que variation d'expression par rapport à un échantillon prédéterminé, car la quantification absolue ne sera pas exacte.

4. Transfert des surnageants d'échantillons sur des cellules perméables

1. Observer au microscope optique les cellules Vero ensemencées dans la plaque 96 puits à fond clair afin de confirmer que les monocouches sont confluentes à au moins 95 %.
2. Transférer 25 μl de surnageant d'échantillon sur les cellules Vero ensemencées dans des plaques à parois blanches. Ne pas transférer les surnageants dans les 2 colonnes désignées pour les courbes standards. 
   REMARQUE : Cette étape peut être réalisée simultanément pour tous les puits d'une même plaque à l'aide d'un distributeur liquide à 96 canaux.
3. À l’aide d’une pipette multipipette à 8 ou 12 canaux, ajouter 25 μl de chaque dilution de la courbe standard préparée à l’étape 3 sur les cellules Vero des 2 colonnes désignées.
4. Centrifuger les plaques pendant 5 min à 430 x g à température ambiante (TA).
5. Incuber pendant 5 h à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu de Dulbecco modifié (DMEM)	Corning	SH30243.01
Sérum de veau fœtal	NorthBio Inc.	NBSF-701
Solution saline tamponnée au phosphate	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Préparer une solution à 1 mM, pH 7,3
Plaques microplaque en polystyrène traitées pour la culture cellulaire, 96 puits, fond plat blanc solide	Corning	3917	Des plaques 384 puits peuvent également être utilisées pour un débit plus élevé
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Lecteur de microplaque à monochromateur
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	Système de pipetage manuel à 96 embouts
Embouts Liquidator96 LTS stérilisés avec filtres	Mettler Toledo	LQR-200F	Tout embout stérile filtré compatible avec les pipettes choisies est approprié
Microflo	BioTek	111-206-21	Utilisé pour ensemencer les cellules dans une plaque 96 puits
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Fluoromètre pour microplaque