Génération de cellules souches embryonnaires de souris infectées par un lentivirus

Résumé

Source : Chiarella, A. M. et. al., Répression de la transcription génique en redirigeant le mécanisme cellulaire à l’aide de modificateurs épigénétiques chimiques. J. Vis. Exp. (2018)

Ce vidéo montre la génération de cellules souches embryonnaires de souris génétiquement modifiées par transduction lentivirale. Les particules lentivirales délivrent un marqueur de résistance aux antibiotiques, permettant l'intégration génomique stable et la sélection des cellules transduites.

Protocole

1. Infection de cellules souches embryonnaires de souris (mESC) avec un lentivirus

1. Cultiver des cellules souches embryonnaires de souris (mESC) à faible passage (moins de passage 35), adaptées à l'essai de chromatine in vivo (CiA), en milieu de base DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) à haute teneur en glucose, complété avec 20 % de sérum bovin fœtal (FBS) de qualité pour cellules souches embryonnaires, 10 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES), des acides aminés non essentiels (NEAA) 1x, pénicilline/streptomycine (Pen/Strep), du 2-mercaptoéthanol et un facteur d'inhibition de la leucémie (LIF) dilué à 1:500, dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   REMARQUE : Le LIF est obtenu à partir du surnageant de cellules Cos productrices de Lif-1C-alpha (COS LIF), qui sont collectées par lots et congelées à -80 °C.
   1. Cultiver les cellules sur des plaques préincubées pendant 1 à 3 heures avec 0,1 % de gélatine dans du PBS 1x (phosphate-buffered saline), puis rincées avec du PBS 1x. Alimenter les cellules quotidiennement et les repiquer toutes les 2 à 3 journées, selon leur densité.
      REMARQUE : Morphologiquement, les colonies de cellules souches embryonnaires (ES) doivent être petites, rondes et bien distinctes les unes des autres.
2. Repiquer les mESC en format plaque 12 puits (100 000 cellules/puits) un jour avant l'infection.
   1. Compter les cellules à l'aide d'un hématimètre. Pour les cellules cultivées en format 10 cm, aspirer l'ancien milieu, ajouter 5 mL de PBS 1x, aspirer le PBS, puis ajouter 1 mL de trypsine 0,25 %. Incuber les cellules dans la trypsine pendant 8 minutes à 37 °C, en agitant et en tapotant les cellules à mi-incubation. L'objectif de cette étape est d'obtenir une suspension monocellulaire.
3. 48 heures après le changement de milieu des cellules rénales embryonnaires humaines 293T (HEK) provenant de la plaque 15 cm, prélever et transférer le surnageant dans un tube conique de 50 mL.
4. Centrifuger le surnageant à 300 x g pendant 5 minutes afin de former un culot de débris cellulaires.
5. Filtrer le surnageant à travers une membrane de 0,45 µm.
   REMARQUE : Veiller à utiliser des membranes en acétate de cellulose sans surfactant (SFCA), car certains autres matériaux peuvent retenir le virus et réduire fortement les rendements.
6. Concentrer le virus par ultracentrifugation, en utilisant une centrifugeuse équipée d'un rotor SW32, et faire tourner à 20 000 tr/min (~72 000 x g) pendant 2,5 heures à 4 °C.
7. Pendant la concentration du virus par ultracentrifugation, traiter les mESC CiA dans la plaque 12 puits avec un milieu ES frais contenant 5 µg/mL de polybrene.
8. Lorsque la concentration du virus est terminée, aspirer soigneusement le surnageant et resuspendre le culot viral dans 100 µL de PBS 1x (éviter les bulles excessives).
9. Ajouter le virus et le PBS 1x dans un tube microfuge de 1,5 mL. Vortexer/agiter le tube à 300 x g (ou au réglage le plus bas) afin de resuspendre complètement le virus. Centrifuger brièvement le tube dans une mini-centrifugeuse de table pendant 5 à 10 secondes pour éliminer les bulles.
10. Ajouter 30 µL du virus dans chaque puits d'une plaque 12 puits. Agiter doucement la plaque, puis la centrifuger à 1 000 x g pendant 20 minutes.
    REMARQUE : La quantité de virus ajoutée peut varier selon le titre viral, qui est inversement proportionnel à la taille du vecteur d'expression.
    1. Alternativement, congeler rapidement le virus à l'azote liquide et le stocker à -80 °C. Toutefois, la congélation du virus réduit le titre viral.
11. Remettre la plaque 12 puits dans l'incubateur à 37 °C et changer le milieu le lendemain matin (~16 heures plus tard) par du milieu ES frais.
12. Après 48 heures d'infection, sélectionner les cellules ayant intégré le plasmide viral en ajoutant l'antibiotique approprié (par exemple, 1,5 µg/mL de puromycine, 10 µg/mL de blasticidine, etc.). Changer le milieu quotidiennement et rincer les cellules avec du PBS 1x si la majorité des cellules sont en suspension ou mortes. Maintenir les cellules sous milieu de sélection pendant 72 à 96 heures dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Corning	10-013CV
AAEN	Gibco	11140-050
HEPES (pour culture tissulaire)	Corning	25-060-Cl
Sérum de veau fœtal (FBS)	Atlantic Biologicals	S11550	Chaque lot testé individuellement pour la qualité
Tubes de centrifugation pour virus	Beckman Coulter	344058
Mémoire filtrante pour virus	Corning	431220
Polybrene	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
Trypsine à 0,25 %	Gibco	25200-056	avec EDTA
Trypsine à 0,05 %	Gibco	25400-054	avec EDTA
Puromycine	InvivoGen	ant-pr
Ultracentrifugeuse	Optima	XPN-80
Rotateur de centrifugeuse SW-32	Beckman Coulter	14U4354
Godets de centrifugeuse SW-32 Ti	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 cellules rénales embryonnaires humaines	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
CiA:Oct4 mESC	Don généreux de G. Crabtree
Cellules Cos productrices de Lif-1C-alpha	Don généreux de J. Wysocka