Identification des cellules infectées par le virus vaccini recombinant par sélection métabolique et fluorescente

Résumé

Source : Marzook, N. B., et al., Méthodologie pour la génération efficace de protéines virales de la vaccine marquées par fluorescence. J. Vis. Exp. (2014)

Ce vidéo montre la génération de virus vaccinia recombinants par recombinaison homologue médiée par plasmide dans des cellules épithéliales infectées. Des marqueurs fluorescents et métaboliques permettent la sélection et l'identification de virus exprimant des protéines marquées.

Protocole

Génération de virus recombinants

1. Conformément à la Figure 1, infecter une monocouche de cellules BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (une lignée cellulaire épithéliale de rein de singe dérivée des cellules CV-1)] avec le virus vaccinia dans un milieu sans sérum à une multiplicité d'infection (MOI) > 1.
2. Une heure après l'infection, récupérer les cellules avec le milieu de Dulbecco modifié (DMEM) et transfecter avec un mélange de plasmide vecteur de recombinaison et de réactif de transfection dans un rapport de 3:1 dans un milieu sans sérum.
3. Après 24 heures, racler et récupérer les cellules dans du DMEM ne contenant pas de sérum bovin fœtal (FBS) et effectuer trois cycles de congélation-décongélation pour lyser les cellules et libérer les particules virales.
4. Réaliser un test de plaque avec une couche liquide de DMEM contenant 10 % de FBS et les réactifs de sélection GPT (phosphoribosyltransférase de la guanine (provenant de E. coli), l'acide mycophénolique (25 µg/ml) et la xanthine (250 µg/ml) comme suit :
   1. Ensemencer une plaque 6-puits avec une monocouche de cellules BS-C-1.
   2. Infecter des monocouches cellulaires à confluence de 100 % avec des dilutions sérielles des cellules soumises aux cycles de congélation-décongélation contenant des particules virales afin d'assurer une séparation adéquate des plaques individuelles.
   3. Couvrir avec du DMEM liquide contenant 10 % de FBS et les réactifs de sélection GPT — acide mycophénolique et xanthine — à des concentrations finales respectives de 25 µg/ml et 250 µg/ml.
5. Après une incubation de 24 heures, retirer la couche liquide et utiliser un microscope à fluorescence pour rechercher des plaques présentant une fluorescence rouge diffuse correspondant à l'incorporation de mCherry provenant du vecteur TDS (sélection dominante transitoire) dans le virus. Selon le gène cible et la balise fluorescente choisie, une fluorescence localisée du gène marqué peut également être observée sur la même plaque rouge.
6. Prélever plusieurs plaques pour chaque virus recombinant par raclage localisé à l’aide d’une pointe de pipette et de 100 µl de DMEM contenant 5 % de FBS afin de transférer les cellules dans un tube Eppendorf, suivi de trois cycles de congélation-décongélation des cellules raclées pour libérer les virus recombinants.
7. Ajouter le DMEM contenant le virus soumis aux cycles de congélation-décongélation à une monocouche de cellules dans une plaque 12-puits afin d'amplifier les virus recombinants en présence des réactifs de sélection GPT dans le milieu de croissance. Racler les amplifications réussies 24 heures après l'infection.
8. Réaliser un test de plaque des plaques amplifiées avec succès présentant une fluorescence rouge, cette fois avec une couche d'agarose et sélection GPT, comme suit :
   1. Ensemencer une plaque 6-puits avec une monocouche de cellules BS-C-1.
   2. Effectuer une dilution sérielle des virus recombinants et infecter les puits avec des dilutions croissantes de virus dans du DMEM sans FBS.
   3. Une heure après l'infection, retirer le milieu liquide et recouvrir chaque puits de 0,5 % d'agarose dans un milieu essentiel minimum (MEM) contenant 2,5 % de FBS, 292 µg/ml de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine, ainsi que les réactifs de sélection GPT.
9. Deux à trois jours après l'infection, sélectionner les plaques présentant une fluorescence à la fois rouge et de la couleur de la balise fluorescente choisie afin de les amplifier à nouveau, cette fois sans sélection GPT.
10. Réaliser le test de plaque suivant avec une couche d'agarose sans sélection.
11. Prélever les plaques ayant perdu leur fluorescence rouge diffuse mais conservant la fluorescence localisée correspondant à la balise choisie.
12. Poursuivre la purification par plaques sans sélection afin d'obtenir un stock pur de virus recombinants ayant perdu les gènes de sélection mCherry et gpt mais conservant la fluorescence localisée correspondant à la balise choisie. Vérifier la pureté des stocks par test de plaque ; toutes les plaques doivent présenter un phénotype de plaque similaire.

Résultats

Figure 1. Aperçu du protocole expérimental permettant de créer un virus vaccinia recombinant. Les événements survenant aux niveaux génétique et cellulaire sont illustrés, accompagnés d'images représentatives de plaques décrivant les étapes suivant la création d'un virus vaccinia fluorescent marqué A3-GFP. (A) Des cellules infectées par le virus vaccinia sont transfectées avec le vecteur de recombinaison TDS. (B) Dans cette figure, seul le résultat de la recombinaison gauche est représenté, et l'exemple utilise GFP comme marqueur fluorescent choisi. La recombinaison droite entraînerait l'incorporation complète du plasmide TDS dans le génome d'une manière similaire, sauf que la balise serait fusionnée à l'ensemble du gène cible à l'étape intermédiaire, c.-à-d. l'étape C. Un dosage de plaques est effectué sur une monocouche cellulaire à l'aide du mélange de recombinaison et soumis à une sélection GPT. (C) Des plaques présentant une fluorescence rouge et verte, correspondant respectivement à l'expression de mCherry et de GFP, sont sélectionnées et amplifiées. Une fois la sélection retirée, il y a perte de la fluorescence rouge correspondant à l'élimination des gènes gpt et mCherry (D), et des plaques présentant exclusivement une fluorescence verte sont sélectionnées et amplifiées (E).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide mycophénolique	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Dissoudre dans du NaOH 0,1 N
Xanthine	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Dissoudre dans du NaOH 0,1 N
Réactif de transfection FuGENE HD	Promega	E2311
Microscope à fluorescence équipé des filtres Chroma 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)