Transduction adénovirale combinée et knockdown médié par siRNA dans des cellules cancéreuses

Résumé

Source : Fuchs, M. et al. Adenofection : une méthode pour étudier le rôle des chaperonnes moléculaires dans la morphodynamique cellulaire par des expériences de déplétion-rémission. J. Vis. Exp. (2016)

Ce vidéo démontre la livraison, médiée par un adénovirus, d'un transgène fluorescent combinée à une transfection par siRNA–phosphate de calcium dans des cellules de cancer du col de l'utérus. L'adénovirus exprime une protéine de remplacement fluorescente, tandis que le siRNA induit une dégradation ciblée de l'ARNm par liaison au complexe RISC. Cette co-transfection séquentielle permet une inhibition simultanée de la protéine endogène et un sauvetage fonctionnel par le transgène, permettant ainsi la visualisation et la confirmation du remplacement protéique par imagerie de fluorescence.

Protocole

1. Transduction par adénovirus et inhibition de la protéine endogène par transfection d'ARN interférents courts (ARNi) dans des cellules HeLa-RFP-H2B à l'aide de précipités de phosphate de calcium (CaPi)

REMARQUE : Un adénovirus contrôle portant un gène non lié (par exemple, LacZ) ou aucun gène n'est utilisé pour atteindre une multiplicité d'infection (MOI) minimale dans toutes les adénofections (10-20 unités formant des plaques (PFU)/cellule), en utilisant la plus faible quantité d'adénovirus recombinant portant le gène d'intérêt.

REMARQUE : Cette procédure s'est révélée utile pour normaliser l'expression par cellule dans une population cellulaire importante.

1. Un jour après le semis des cellules, compter le nombre de cellules à partir de la boîte supplémentaire ensemencée. Aspirer le milieu et rincer une fois avec 1 mL de trypsine à 0,05 % / acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA). Ajouter à nouveau 1 mL de trypsine à 0,05 % / EDTA et incuber à 37 °C, 5 % CO₂₂ jusqu'à ce que toutes les cellules se soient détachées. Dissocier soigneusement les cellules à l’aide d’une pipette de 1 mL et dénombrer le nombre de cellules par mL à l’aide d’un hématimètre.
2. Déterminer la quantité de virus nécessaire pour transduire les cellules à un MOI de 2 PFU de la protéine d'intérêt (POI) par cellule et de 18 PFU par cellule d'un vecteur vide (par exemple, LacZ), afin d'obtenir un total de 20 PFU par cellule. Parallèlement, transduire 4 PFU de chaque baculovirus codant pour l'actine marquée par la protéine verte fluorescente (GFP) et la protéine rouge fluorescente (RFP) marquée α-tubuline. Transduire les cellules en utilisant le protocole d'adénofection suivant.
3. Préparer dans une hotte stérile un tube en plastique de 1,5 mL pour chaque condition et ajouter 400 μL de milieu minimum essentiel alpha chaud (αMEM)
4. Décongeler lentement une aliquote des virus sur de la glace et, si nécessaire, diluer l'agent viral afin de pouvoir pipeter un volume supérieur à 1 μL afin de minimiser les erreurs de pipetage.
5. Ajouter la quantité de virus calculée par condition à chaque tube en plastique de 1,5 mL contenant 400 μL αMEM et mélanger doucement par pipetage. Remettre immédiatement le stock de virus à -80 °C pour conserver son activité.
6. Aspirez le milieu des cellules et ajoutez délicatement le mélange viral goutte à goutte à l’aide d’une pipette. Incubez les cellules à 37 °C, 5 % CO₂₂ et agiter délicatement les plaques sous la hotte stérile toutes les 15 minutes pendant 1 heure afin de garantir une bonne couverture des cellules par le virus. L'utilisation d'une faible quantité de milieu facilite le contact entre le virus et les cellules.
7. Après l'incubation, prélevez délicatement 1,6 mL αMEM à chaque plaque afin d'obtenir un volume total de 2 mL, débuter la synchronisation cellulaire en ajoutant de la thymidine à 2 mM et incuber les cellules pendant 2 heures supplémentaires à 37 °C, 5 % CO₂₂.
8. Pendant ce temps, préparez le mélange de transfection d'ARNi en suivant la méthode de transfection par phosphate de calcium (voir Figure 1). Si aucun ARNsi n'est nécessaire, remplacer la quantité d'ARNsi par de l'eau stérile afin de réaliser une transfection vide.
9. Calculer 200 μL mélange pour chaque condition, ce qui donne 400 μL par duplicat. L'exemple suivant est donné pour une concentration finale de siRNA de 50 nM et doit être adapté à chaque protéine d'intérêt. Dans un tube en plastique de 1,5 mL, pipeter 50 μL 1 M CaCl₂₂ et 11 μL 20 μM siRNA dans 139 μL H stérile₂O et mélanger par vortexage. Après une courte centrifugation, ajouter soigneusement 200 μL 2× Solution saline tamponnée à l'HEPES (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES), 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,01-7,05) goutte à goutte.
   REMARQUE : Plus les gouttes sont petites, plus les précipités sont petits, ce qui entraîne une meilleure efficacité de transfection. Mélanger doucement trois fois par injection d'air en utilisant une 200 μL pipette
10. Incuber le mélange 30 min à température ambiante (TA). Ajouter lentement 200 μL du mélange de transfection dans chaque plaque et agiter transversalement. Transférer les plaques vers 37 °C, 5 % CO₂₂ pendant 16 h.
11. Le lendemain, rincer les cellules deux fois avec 2 mL de HEPES chaud (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) et ajouter 2 mL αMEM. Ne pas traiter plus de quatre plaques cellulaires à la fois, car les variations de température affectent la durée du cycle cellulaire.
12. Visualiser l'efficacité d'infection au microscope fluorescent inversé avec un grossissement de 20 à 40x (air), et acquérir trois images représentatives par condition dans les deux canaux, fluorescent et de transmission, pour la documentation. Sept heures plus tard, ajouter 2 mM de thymidine et incuber pendant 16 heures supplémentaires à 37 °C, 5 % CO₂₂.
13. Le jour suivant, 48 h après la transfection par ARNsi et l'infection virale, rincer les cellules deux fois avec 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) tiède et les laisser en incubation pendant 7 h dans 2 mL αMEM sans Phénol Rouge pour l'imagerie de cellules vivantes ou avec Phénol Rouge pour l'extraction des protéines.
14. Récolter les cellules pour chaque condition 48 heures après la transfection afin de préparer des extraits protéiques et d'effectuer une analyse par immunotransfert (Western blot) pour déterminer l'efficacité de l'extinction et l'expression de la protéine endogène.
    REMARQUE : Utilisez des anticorps dirigés contre la protéine d'intérêt ainsi que des anticorps appropriés servant de contrôles de chargement. L'efficacité de l'extinction doit être déterminée en chargeant des quantités décroissantes de lysats cellulaires témoins (transfectés avec un ARNi témoin) afin d'obtenir une courbe de titration (c'est-à-dire 1, ½, ¼, ⅛).

Résultats

Figure 1. Planification d'un protocole typique d'adénofection. Les étapes successives d'une expérience typique sont présentées pour le protocole utilisant des précipités de phosphate de calcium (soulignés en gris) ou le protocole utilisant un réactif de transfection à base de lipides cationiques (mis en évidence en jaune), incluant l'ensemencement des cellules, la transduction par des adénovirus et des baculovirus, la transfection par des duplex d'ARNsi et la synchronisation cellulaire par un blocage double au thymidine. Les chronologies en heures pour les deux protocoles sont indiquées sur le côté droit de la figure.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
EDTA	Sigma	E5134
Sérum de veau fœtal (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectine	Sigma	F1141
Plaques à fond de verre, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Don gracieux du Dr Sabine Elowe, Québec, Canada
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
Milieu Essentiel Minimum (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Milieu Essentiel Minimum (MEM) Alpha sans désoribonucléosides/ribonucléosides	Thermo Fisher	12000-022
Milieu Essentiel Minimum (MEM) Alpha sans rouge de phénol	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
Conception personnalisée d'adénovirus	Welgen	Custom design
Chlorure de calcium	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actine-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubuline-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Duplexes d'ARNsi	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Tripsine 2,5 %	Thermo Fisher	15090-046