Marquage des résidus cystéine accessibles en surface dans des particules pseudo-virales modifiées

Résumé

Source : Natilla, A. et Hammond, R. W. Analyse de l'accessibilité au solvant des résidus de cystéine sur des particules pseudovirales du virus de la rayure fine du maïs produites chez Nicotiana benthamiana et liaison croisée de peptides aux particules pseudovirales. J. Vis. Exp. (2013)

Ce vidéo montre le marquage fluorescent spécifique à un site de particules pseudovirales (VLPs) mutées produites dans Nicotiana benthamiana à l'aide d'un colorant réactif au thiol, suivi d'une purification et d'une électrophorèse sur gel pour confirmer la modification de surface.

Protocole

1. Inoculation virale et purification des particules pseudovirales (VLPs) à partir de plantes de Nicotiana benthamiana

1. Produire des transcrits d'ARN-T7 coiffés à partir de plasmides vecteurs dérivés du virus X de la pomme de terre (PVX) portant les gènes de la protéine de capside (CP) sauvage (wt) et mutée sur la cystéine du virus Maize rayado fino (MRFV), en utilisant le kit T7-mMessage mMachine d' Ambion.
2. Pour chaque réaction de transcrit T7, inoculer deux feuilles complètement développées de N. benthamiana avec 10 μL de réaction et incuber les plantes pendant 10 jours en serre, à 60 % d'humidité, pendant 16 h avec lumière (25 000-30 000 lux) à 25 °C et 8 h d'obscurité à 20 °C.
3. Récolter les feuilles infectées par le virus de N. benthamiana 10 jours après l'inoculation (dpi), peser le tissu végétal (50 grammes) et placer sur de la glace.
4. Homogénéiser le matériel végétal dans un mixeur en présence de 100 mL d'une solution fraîche de tampon au citrate de sodium 0,5 M, pH 5,5 (utiliser 2 mL de tampon par gramme de tissu végétal).
5. Filtrer l'homogénat à travers 3 couches de gaze et clarifier par centrifugation à 27 000 × g pendant 30 min. Transférer le surnageant dans un cylindre gradué prérefroidi, mesurer le volume, puis transférer dans un bécher stérile prérefroidi. Éliminer le culot.
6. Traiter le surnageant en ajoutant 10 % de polyéthylène glycol 8 000 (PEG 8 000), agiter pendant 15 min à 4 °C, puis incuber pendant 45 min supplémentaires à 4 °C afin de précipiter la matrice de particules pseudo-virales (VLPs) avec le PEG.
7. Centrifuger l'échantillon à 27 000 × g pendant 20 min à 4 °C et éliminer le surnageant.
8. Traiter le culot en ajoutant 8 mL de tampon au citrate de sodium 0,05 M, pH 5,5, contenant 2 % de Triton X-100. Agiter soigneusement les tubes de centrifugation pour libérer le culot. Transférer le culot et le tampon dans un bécher stérile prérefroidi. Rincer immédiatement les tubes avec 2 mL du même tampon et ajouter au bécher. Agiter la suspension à 4 °C jusqu'à dissolution complète des culots (généralement 1 h).
9. Clarifier par centrifugation pendant 5 min à 27 000 × g, éliminer le culot, puis traiter le surnageant par centrifugation à 140 000 × g pendant 2 h à 4 °C.
10. Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon au citrate de sodium 0,05 M, pH 5,5, puis déposer la suspension sur un gradient de saccharose 10-40 % préparé dans le tampon au citrate de sodium 0,05 M, pH 5,5.
11. Centrifuger le gradient pendant 3 h à 140 000 × g à 4 °C.
12. Éclairer le haut du tube de centrifugation et recueillir la bande supérieure diffusante située à 4 cm du sommet du tube, diluer avec du tampon au citrate de sodium 0,05 M, pH 5,5, puis centrifuger pendant 3 h à 140 000 × g à 4 °C.
13. Resuspendre le culot dans 0,5 mL d'eau stérile et conserver à 4 °C pendant jusqu'à six mois.
14. Quantifier la concentration des VLPs en réalisant un dosage protéique de Bradford. Le rendement des VLPs est compris entre 1 et 3 μg/g de tissu végétal.

2. Réactions de marquage au fluorescéine-5-maléimide des VLP

1. Préparer une solution de fluorescéine-5-maléimide (427,37 g/mole) à 1 mM dans un tampon phosphate de sodium 50 mM, pH 7,0 ; 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Mélanger à l’aide d’un vortex et vérifier la dissolution complète. Protéger le tube de la lumière à l’aide de papier d’aluminium.
2. Ajouter la fluorescéine-5-maléimide aux VLP produites à l’étape 1 et mélanger. Utiliser un excès molaire de fluorescéine-5-maléimide de 25 fois la quantité molaire de groupements sulfhydryle. En général, l’utilisation de 30 μL de VLP à une concentration de 1 μg/μL et de 60 μL de la solution de fluorescéine-5-maléimide donne des résultats satisfaisants.
3. Incuber la réaction pendant 2 heures à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
4. Arrêter la réaction en ajoutant du dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 50 mM.
5. Éliminer la fluorescéine non réagie à l’aide d’une colonne de désalinisation par centrifugation (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) et par centrifugation pendant 2 min à 1 500 × g à température ambiante.
6. Pour l’analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), ajouter 10 μL de tampon d’échantillonnage Laemmli 2 × SDS-PAGE à 10 μL de chaque réaction. Conserver la protéine marquée à l’abri de la lumière à 4 °C pendant un mois au maximum ou en aliquots à usage unique à -20 °C pendant 3 mois au maximum.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes ultratransparentes à paroi mince	Beckman	344059
Kit mMESSAGE mMACHINE T7	Life Tecnologies	AM1344M
Fluorescéine-5-maléimide	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	Le produit 46130 est indisponible, le remplacer par F150
Buffer de Laemmli	Bio-Rad	1610737
Buffer de migration Tris-glycine SDS (dodécylsulfate de sodium)	Invitrogen	LC2675
Buffer de transfert Tris-glycine	Invitrogen	LC3675
Sandwich de papier filtre et membrane de nitrocellulose	Invitrogen	LC2001
Maleimide-Polyéthylène glycol (PEG) 2-Biotine EZ-Link, format sans pesée	Thermo Scientific	21901