Production de particules pseudo-virales dans des E. coli modifiés génétiquement

Résumé

Source : Chen, Z., et al. Fabrication de particules pseudovirales marquées par fluorescence et PEGylées par chimie du dibromomaléimide-disulfure. J. Vis. Exp. (2018)

Ce vidéo montre la méthode de l'expression contrôlée de la protéine de capside du bactériophage Qβ dans des E. coli modifiés. Les protéines résultantes s'assemblent spontanément en des particules de type viral, qui sont ensuite récoltées pour une bioconjugaison en aval.

Protocole

Expression de Qβ

1. Nettoyer la surface de la paillasse avec une solution d’eau de Javel/éthanol à 1:1.
2. Préparer deux cultures initiales de 3 mL dans un environnement aseptique en ajoutant des colonies isolées d’E. coli BL21(DE3) dans 3 mL de milieu Super Optimal Broth (SOB) dans un environnement aseptique.
3. Faire croître les cultures sur un agitateur à 250 tr/min dans une pièce à 37 °C et 0 % d’humidité relative (rH) pendant la nuit.
4. Inoculer la culture initiale dans le milieu SOB :
   1. Retirer les deux cultures initiales de 3 mL de l’agitateur et, dans un environnement aseptique, verser chaque culture dans l’un des deux flacons Erlenmeyer de 2 L à collerettes contenant chacun 1 L de milieu SOB frais.
   2. Placer le milieu inoculé sur un agitateur à 250 tr/min dans une pièce à 37 °C et 0 % d’humidité relative (rH).
5. Faire croître les bactéries sur un agitateur à 250 tr/min dans une pièce à 37 °C et 0 % d’humidité relative (rH) jusqu’à ce que l’OD₆₀₀ atteigne 0,9–1,0.
6. Ajouter 1 mL d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à 1 M à l’aide d’une pipette P1000 pour induire l’expression protéique.
7. Laisser le milieu sur l’agitateur à 250 tr/min dans une pièce à 37 °C et 0 % d’humidité relative (rH) pendant la nuit.
8. Le lendemain matin, retirer le milieu de l’agitateur et le centrifuger dans des bouteilles de 1000 mL à 20 621 × g pendant 1 h à 4 °C pour récolter les cellules.
9. Jeter le surnageant et récupérer le culot cellulaire.
   1. Verser le surnageant dans un flacon contenant environ 5 mL d’eau de Javel pour tuer les bactéries. Ceci constitue un déchet.
   2. Utiliser une spatule pour racler le culot cellulaire du fond de la bouteille de centrifugation et transférer le culot dans un tube de centrifugation de 50 mL.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bouillon LB (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Tryptone, poudre	Research Products International	T60060-1000.0
Extrait de levure, poudre	Research Products International	Y20020-1000.0
Sulfate de magnésium anhydre	P212121	CI-06808-1KG
Chlorure de sodium (cristallin/Certifié ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Chlorure de potassium	Fisher Scientific	BP366-500
Système de purification d'eau Elga PURELAB Flex 3	Fisher Scientific	4474524
Phosphate monobasique de potassium	Fisher Scientific	BP362-1
Phosphate dibasique de potassium anhydre	Fisher Scientific	P288-500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Bouteilles de centrifugation Nalgene avec bouchons, en copolymère de polypropylène	Thermo Scientific	3141-0250
Agitateur orbital VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Tubes coniques de centrifugation Falcon de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22