Fonctionnalisation fluorescente de particules pseudo-virales par recomposition de ponts disulfures

Résumé

Source : Chen, Z., et al. Réalisation de particules pseudovirales PEGylées fluorescentes induites par conjugaison à l'aide de la chimie dibromomaleimide-disulfure. J. Vis. Exp. (2018)

Ce vidéo montre la fonctionnalisation fluorescente de particules de type viral par re-formation de ponts disulfure réduits à l'aide d'un agent liant polyéthylène glycol (PEG), produisant des conjugués stables et traçables, adaptés à l'imagerie cellulaire et à la délivrance ciblée dans les applications biomédicales.

Protocole

1. Conjugaison de composés dibromomaléimide (DB) sur le bactériophage Qβ

1. Réduire les ponts disulfure sur Qβ.
   1. Dissoudre 0,0020 g de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) dans 1 mL d'eau ultrapure pour préparer une solution mère 100x.
      REMARQUE : Préparer le TCEP fraîchement avant la réduction.
   2. Ajouter 200 µL de Qβ (5 mg/mL) dans un tube de microcentrifugation.
   3. Puis ajouter 20 µL de la solution mère de TCEP 100x.
   4. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
2. Rétablir les ponts disulfure réduits à l'aide de polyéthylène glycol dibromomaléimide (DB-PEG).
   1. Dissoudre 0,0017 g de polyéthylène glycol dibromomaléimide (DB-PEG) dans 100 µL de DMF.
   2. Ajouter 680 µL d'une solution de phosphate de sodium 10 mM (pH 5).
   3. Ajouter le Qβ réduit à la solution de DB-PEG et observer le processus de mélange sous une lampe UV (ultraviolets) à 365 nm. La fluorescence jaune vif peut être visualisée immédiatement à l’aide d’une lampe UV portative à 365 nm dès le mélange.
   4. Laisser la réaction se poursuivre toute la nuit à température ambiante (TA) sur un agitateur rotatif.
3. Purifier le mélange réactionnel par filtration centrifuge (coupure moléculaire (MWCO) = 10 kDa) trois fois à l’aide de PBS 1x (solution saline tamponnée au phosphate) à 3 283 × g pendant 20 min à 4 °C.
4. Surveiller la conjugaison par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS non réducteur (SDS-PAGE) et par électrophorèse sur gel d'agarose natif.
   REMARQUE : Les particules pseudovirales (VLP) migrent sous forme de particules intactes dans le gel d'agarose natif, et elles sont séparées en fonction de leur charge, de leur taille et de leur forme.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2,3-Dibromomaleimide 97 %	Sigma Aldrich	553603-5G
Polyéthylène glycol	Alfa Aesar	41561-22
Phosphate de sodium	Fisher Scientific	AC424375000
Acrylamide/bis-acrylamide	P212121	RP-A11310-500.0
Sulfate de dodécylsodium	Sigma Aldrich	L3771-100G
Persulfate d'ammonium	Fisher Scientific	BP179-100
Unités filtrantes centrifuges Amicon Ultra-4	Millipore Sigma	UFC801024
Tubes coniques de centrifugation Falcon de 15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
Tubes de microcentrifugation : 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Agitateur orbital VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P200	Gilson	F123601
Pipetman P100	Gilson	F123615
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P10	Gilson	F144802
Balance de laboratoire classique haute précision Intel Weighing PM-100	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100