Préparation sécurisée d'échantillons viraux pour la microscopie électronique à transmission

Résumé

Source : Blancett, C. D., et al. Utilisation de capsules pour la coloration négative d'échantillons viraux en confinement biologique. J. Vis. Exp. (2017).

Ce vidéo montre la préparation sécurisée d'échantillons viraux pour la microscopie électronique en transmission. Les particules virales sont fixées avec du glutaraldéhyde, colorées avec un agent dense en électrons, puis soumises à une fixation par vapeur d'osmium tétraoxyde afin de stabiliser les structures et garantir une inactivation complète, permettant ainsi une manipulation sécurisée des échantillons viraux tout en améliorant le contraste pour une imagerie TEM de haute qualité.

Protocole

1. La méthode de la capsule pour la coloration négative en confinement biologique utilisant du glutaraldéhyde aqueux et de la vapeur d'osmium tétraoxyde à 1 % pour l'inactivation

1. À l'intérieur de la cabine de sécurité biologique (CSB) de confinement biologique, aspirer 40 µL de suspension virale dans la capsule fixée à une pipette.
   REMARQUE : La pipette reste fixée à la capsule jusqu'à la fin du processus.
2. Placer la pipette sur le côté pendant 10 min, les grilles orientées horizontalement. Cela permet de favoriser une répartition uniforme des particules virales sur les grilles revêtues.
3. Inactiver le virus à l'intérieur de la capsule, dans la CSB de confinement biologique.
   1. Prendre la pipette et appuyer sur le piston pour délivrer la solution virale dans un récipient de déchets.
   2. Aspirer 40 µL de fixateur au glutaraldéhyde 2 % dans les capsules. Attention : le glutaraldéhyde est un produit chimique dangereux et nécessite une protection appropriée. Il peut être utilisé pendant de courtes périodes dans une CSB ordinaire, mais une exposition prolongée à l'air libre exige de travailler dans une CSB à évacuation ou sous hotte chimique.
   3. Placer la pipette sur le côté pendant 20 min. Cela permet de s'assurer que les échantillons sont bien fixés.
   4. Éjecter le fixateur et aspirer 40 µL d'eau DI (désionisée) dans les capsules pour rincer le fixateur. Répéter cette étape de rinçage pour un total de 3 cycles de rinçage.
4. Aspirer 40 µL d'acétate d'uranyle (UA) à 1 % ou d'acide phosphotungstique de potassium (PTA) à 1 % dans les capsules et laisser agir pendant 30 s.
   REMARQUE : La durée de coloration peut varier de 10 s à 1 min selon l'échantillon viral.
   ATTENTION : L'UA est un émetteur alpha et une toxine cumulative. Manipuler avec les protections appropriées.
5. Retirer la capsule de la pipette et sécher les grilles par capillarité en touchant le bord des grilles avec un morceau de papier filtre, les grilles restant à l'intérieur de la capsule.
6. Procédure d'inactivation par la vapeur d'osmium tétraoxyde.
   1. Placer la capsule, couvercle ouvert, dans un tube à centrifuger de 50 mL contenant du papier filtre imprégné d'une solution d'osmium tétraoxyde à 1 %. Attention : l'osmium tétraoxyde est extrêmement toxique et possède une faible pression de vapeur. Il doit être manipulé dans une CSB à évacuation ou sous hotte chimique. Manipuler avec les protections appropriées. Afficher les informations d'avertissement dans la zone de travail.
   2. Fermer hermétiquement le tube à centrifuger de 50 mL pendant 1 h afin de permettre une pénétration complète de la vapeur d'osmium tétraoxyde. Ensuite, décontaminer et transférer le tube hors du confinement vers l'installation de microscopie électronique (ME) de niveau BSL-2.
7. Retirer les grilles ME de la capsule.
   1. Dans l'installation ME de niveau BSL-2, retirer la capsule du tube à centrifuger et la placer sur une pipette.
   2. Aspirer 40 µL d'eau DI dans la capsule et déverser l'eau dans un récipient de déchets trois fois.
   3. Retirer la capsule de la pipette et sécher les grilles par capillarité en utilisant du papier filtre pour toucher le bord des grilles.
   4. Après séchage à l'air, conserver les grilles en vue d'une imagerie ultérieure par ME (microscopie électronique en transmission).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Grilles de MEV recouvertes de Formvar/carbone	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
Capsules mPrep/g	EMS	85010-01	boîte
Coupleurs mPrep/f	EMS	85010-11	standard 16/Pk
Glutaraldéhyde	EMS	16320	50% solution, qualité EM
Tétroxyde d'osmium	EMS	19190	solution aqueuse à 4%
Acétate d'uranyle	EMS	22400	poudre
Acide phosphotungstique de potassium	EMS	19500	poudre
Papier filtre	Whatman	1450-090	taille 50
Microscope électronique en transmission	JEOL	JEM-1011	TEM