La vidéo montre la détection des intermédiaires d'ARNsd viraux du Zika dans des cellules épithéliales infectées par immunocytochimie. Les cellules infectées sont fixées, puis bloquées avec une solution de blocage. Les anticorps primaire et secondaire sont ajoutés. Les noyaux sont colorés avec un colorant fluorescent. L'ARNsd viral marqué est ensuite observé au microscope à fluorescence.
Article de méthode
Détection des intermédiaires de réplication de l'ARN double brin du virus Zika par immunocytochimie
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30 septembre 2026
Dans cet article
Résumé
Protocole
1. Essai de réplication du génome viral du Zika
- Ensemencer des cellules Vero naïves à raison de 1 x 105 cellules par puits dans des volumes de 2 ml en utilisant une plaque de 12 puits. Le jour suivant, préparer les inoculums viraux (multiplicité d'infection (MOI) de 0,01 et 0,1 ; 400 µl/puits) de faible et forte concentration en utilisant un milieu sans sérum, en triplicata. Pour l'infection témoin, utiliser uniquement le milieu sans sérum (400 µl/puits).
- Incuber la plaque inoculée à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 4 à 6 heures. Répartir l'inoculum en inclinant doucement la plaque latéralement toutes les heures.
- À la fin de l'incubation, remplacer l'inoculum par un milieu enrichi en sérum (2 ml par puits).
- Aux points temporels de 48 et 96 heures, prélever les échantillons pour l'immunocytochimie (ICC).
- Réaliser l'ICC en utilisant les cellules fixées au méthanol.
- Laver les cellules fixées trois fois avec du tampon salin phosphate (PBS) 1x et bloquer avec le tampon de blocage ICC (3 % de sérum de chèvre, 3 % d'albumine sérique bovine (BSA), 0,1 % de Triton X-100 dans le PBS).
- Utiliser l'anticorps monoclonal de souris anti-RNA double brin J2 (1 µg/ml) à une dilution de 1:100 dans le tampon de blocage et incuber toute la nuit à 4 °C.
- Laver les cellules avec du PBS 1x et ajouter un anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de souris-594 (1 µg/ml) à une dilution de 1:1 000 dans le tampon de blocage, puis incuber pendant une heure à température ambiante.
- Laver les cellules avec du PBS 1x, colorer les noyaux à l'aide du colorant Hoechst et observer les cellules au microscope à fluorescence avec un grossissement de 100X (Figure 1).
Résultats
Figure 1 : Essais permettant d'évaluer la réplication du virus Zika (ZIKV). (A) Le graphique montre la charge génomique du virus Zika mesurée par une réaction de transcription inverse suivie d'une PCR quantitative (RT-qPCR). Les amorces pan-génotype (ZIKV GEN) et spécifiques de la souche PRVABC59 (ZIKV UNI) présentaient une sensibilité et une spécificité équivalentes. Comme attendu, les amorces spécifiques du virus de l'hépatite C (HCV) n'ont amplifié aucun produit. (B) Le graphique présente la cinétique de croissance du virus Zika aux points temporels indiqués, dans des cellules infectées à faible et forte concentration, par rapport au témoin non infecté. Les valeurs moyennes et les écarts-types sont indiqués. (C) Essai d'immunocytochimie pour l'étude de la réplication virale. Les cellules infectées par le virus Zika ont été spécifiquement marquées par des anticorps anti-ARNsd. À 48 hpi, les cellules infectées se regroupent en quelques amas, tandis qu'à 96 hpi, la majorité des cellules sont infectées. La coloration à l'Hoechst a été utilisée pour visualiser les noyaux (échelle = 50 µm). BF : image en champ clair.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Anticorps monoclonal de souris anti-ARNdb J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| Ligne cellulaire Vero | ATCC | CCL-81 | |
| Souche virale Zika PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| Microscope à immunofluorescence Nikon Eclipse Ti avec éclairage Nikon Intensilight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
