Concentration et purification des particules virales

Résumé

Source : Fricano-Kugler, C. J., et al. Conception, conditionnement et délivrance de rétrovirus et lentivirus CRISPR à haut titre via injection stéréotaxique. J. Vis. Exp. (2016).

Ce vidéo montre le processus étape par étape de concentration et de purification de particules lentivirales à partir d'une suspension mixte contenant des débris de cellules hôtes. La procédure utilise la centrifugation, la filtration et la précipitation par PEG-sel pour isoler les particules virales tout en éliminant les impuretés solubles. Le produit final est remis en suspension dans un tampon et stocké à des températures ultra-basses afin de préserver l'infectiosité virale et l'intégrité structurale.

Protocole

1. Concentration et purification du virus

1. Préparer une solution 5x de polyéthylène glycol 6000 en ajoutant 40 % de polyéthylène glycol 6000 et 1,5 M de NaCl à de l’eau ddH₂O. Stériliser la solution en autoclave pendant 45 min à 121 °C en cycle liquide. Mélanger lentement la solution pendant le refroidissement.
   REMARQUE : La solution sera initialement trouble, puis deviendra limpide au fur et à mesure du refroidissement.
2. Centrifuger le tube conique de 50 ml contenant les deux récoltes de surnageant viral à 2 000 x g pendant 10 min afin de former un culot du matériel insoluble. Purifier le milieu viral par filtration à travers un filtre seringue à faible liaison aux protéines de 0,45 µm (PES ou PVDF).
3. Ajouter la solution 5x de polyéthylène glycol 6000 au milieu (la concentration finale doit être de 8 % de polyéthylène glycol 6000 et de 0,3 M de NaCl). Mélanger en retournant le tube plusieurs fois (ne pas vortexer). Incuber la solution contenant le polyéthylène glycol et le virus à 4 °C pendant 12 heures ou plus, en remélangeant occasionnellement.
4. (Jour 9) Centrifuger la solution contenant le polyéthylène glycol et le virus à 2 500 x g pendant 45 min. Éliminer et jeter le surnageant, puis effectuer une nouvelle centrifugation pendant 2 min. Retirer et jeter à nouveau le surnageant.
5. Resuspendre le culot en ajoutant 320 µl de solution saline tamponnée au phosphate stérile (les 320 µl correspondent au centième du volume initial du milieu contenant le virus récolté) et incuber toute la nuit à 4 °C. En option, resuspendre le culot à température ambiante sur un agitateur rotatif pendant 30 min.
6. Après la resuspension du culot, aliquoter le virus (5-10 µl par tube de 0,5 ml) et congeler les aliquots à -80 °C (les cycles de congélation-décongélation ou le stockage à 4 °C réduiront fortement le titre).
7. Déterminer le titre des virus selon des protocoles standards, c’est-à-dire réaliser une série de dilutions sur une plaque de 6 puits contenant des cellules HEK293T et compter manuellement les colonies fluorescentes 48 heures plus tard.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Liste des réactifs de transfection
Tubes en polystyrène de 5 ml	Fisher Scientific	352054
Polyéthylène glycol 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
Solution tampon phosphate-saline (PBS) (10x)	National Diagnostics	CL-253
Tubes microcentrifuge de 0,5 ml	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A