Évaluation d'un système de recouvrement liquide pour les essais de plages virales

Résumé

Source : Baer, A. et Kehn-Hall, K. Détermination de la concentration virale par des dosages de plaques : utilisation de systèmes de recouvrement traditionnels et nouveaux. J. Vis. Exp. (2014).

Cette vidéo démontre l'utilisation d'un recouvrement liquide à base de cellulose microcristalline dans un test fondé sur les plaques, en comparant son efficacité dans la formation de plaques virales à celle d'un recouvrement semi-solide à base d'agarose traditionnel.

Protocole

1. Préparation des cellules et des réactifs

1. La veille du dosage, ensemencer les cellules hôtes appropriées pour le virus en question (Tableau 1 et Tableau 2) à une confluence de 90 à 100 %.
2. Préparer une solution de fixation contenant 10 % de formaldéhyde dans H₂Par exemple, mélanger 5,56 ml de formaldéhyde à 36 % en solution mère avec 14,44 ml d'eau distillée H₂O (dH₂O)₂O).
   REMARQUE : Utilisez des pratiques appropriées de manipulation sécuritaire et assurez une ventilation adéquate lors de l'utilisation de formaldéhyde.
3. Préparer la coloration au violet de crésyl : 1 % de violet de crésyl (CV) dans 20 % d'éthanol et d'eau désionisée₂O.
4. Préparer le milieu de plaque 2x (dépendant du type cellulaire, à une concentration 2x ; voir Tableau 2). Filtrer à l’aide d’un 0.2 µm filtrer si des réactifs ne sont pas stériles
5. Préparation des couches de recouvrement immobilisantesTableau 3)
   1. Pour les couches liquides, préparer une solution stérile à 2,4 % d'Avicel dans de l'eau désionisée₂O. Pour éviter l'agglomération, ajouter la poudre dans un flacon contenant de l'eau en agitation rapide à l'aide d'un barreau aimanté, verser lentement l'Avicel et agiter vigoureusement à température ambiante (TA). Lorsque la solution devient trop visqueuse pour être homogénéisée par un barreau aimanté, passer à un agitateur de flacon pour >30 min avec agitation vigoureuse pour assurer une homogénéisation uniforme.
      REMARQUE : Des solutions mères peuvent être préparées à des concentrations plus faibles, mais elles risquent de se séparer et devront être remixées pour assurer une homogénéisation. Des solutions de travail d'Avicel peuvent être utilisées, allant de 0,6 à 3 %.
   2. Après homogénéisation, stériliser la solution en autoclave et la conserver scellée à température ambiante.
   3. Pour les couches de recouvrement en agarose et en carboxyméthylcellulose (CMC), préparez une solution mère dans de l'eau désionisée₂O de CMC à 2 % ou d'agarose à 0,6 %. Mélanger à l'aide d'une barrette magnétique et stériliser à l'autoclave ou au micro-ondes pour obtenir une solution.

2. Dilutions et infections

1. Le lendemain de la mise en culture, vérifiez visuellement la confluence et la viabilité des cellules avant de commencer le test. Assurez-vous que la morphologie cellulaire est normale et qu'une monocouche d'environ 90 % de confluence est présente.
2. Réalisez une dilution sérielle décimale des échantillons infectieux. Utilisez le milieu de croissance cellulaire destiné à la propagation virale comme diluant (Tableau 2). Ajustez le nombre de dilutions en fonction du titre viral attendu, et utilisez toujours un échantillon témoin non infecté afin de confirmer indépendamment la viabilité cellulaire et de faciliter l'identification des plaques.
3. À partir des dilutions sérielles, infectez les cellules pendant 45 min à 1 h (Tableau 1). Utilisez un volume suffisant d'inoculum pour recouvrir les cellules, tout en maintenant ce volume aussi faible que possible afin d'optimiser le contact viral avec la monocouche (Tableau 4). Agitez doucement les plaques toutes les 20 min pour assurer une répartition uniforme et éviter que la monocouche cellulaire ne s'assèche.
4. Après l'infection, ajoutez directement dans chaque puits un volume approprié de milieu immobilisant sur l'inoculum (Tableau 2), en utilisant un mélange 1:1 de milieu de plaque 2x et du système de recouvrement choisi (CMC, agarose ou Avicel). Agitez doucement pour homogénéiser.
   1. Pour les recouvrements liquides, mélangez 1:1 du milieu de plaque 2x préchauffé avec une solution mère d'Avicel à 1,2 - 2,4 % à température ambiante afin d'obtenir une solution de travail contenant 0,6 - 1,2 % d'Avicel.
   2. Pour un recouvrement à l'agarose, utilisez un mélange 1:1 de milieu de plaque 2x préchauffé et d'une solution mère d'agarose à 0,6 % chauffée, puis placez le mélange dans un bain-marie à 56 °C pendant 30 min afin d'équilibrer la température, obtenant ainsi une concentration finale de 0,3 % en agarose/recouvrement.
   3. Pour le CMC, préparez une solution mère à 2 % et traitez-la comme décrit pour le recouvrement à l'agarose.
   4. Lors de l'application du recouvrement sur la monocouche, équilibrez toujours l'agarose ou le CMC chaud à 56 °C dans un bain-marie afin d'éviter d'endommager la monocouche. Veillez à ce que la solution soit tiède, mais pas chaude au toucher, pour prévenir la mort cellulaire et la diminution des titres viraux. La plupart des recouvrements à l'agarose commencent à durcir en dessous de 42 °C ; travaillez rapidement et/ou préparez de petites quantités pour éviter la solidification pendant la manipulation.
5. Après l'ajout du recouvrement, incubez les plaques afin d'obtenir des plaques bien distinctes et facilement dénombrables. La formation des plaques peut prendre de 2 à 14 jours selon le virus analysé (Tableau 1).
   REMARQUE : Une fois les plaques recouvertes d'un milieu liquide placées dans l'incubateur, ne les déplacez plus. Tout déplacement des recouvrements liquides pendant l'incubation entraînera des plaques floues. Les recouvrements à l'agarose et au CMC étant semi-solides, ils peuvent être déplacés ou observés périodiquement au microscope optique pour suivre le développement des plaques.

3. Fixation et coloration des cellules

1. Pour fixer les cellules, versez ou aspirez la couche de recouvrement à base d'Avicel, puis fixez les cellules à l'aide de la solution de formaldéhyde à 10 % pendant 30 minutes à toute la nuit (<1 ml par puits pour une plaque de 6 puits).
   1. Pour l'agarose ou la CMC, ajoutez directement la solution de formaldéhyde sur la couche de recouvrement pendant 1 heure à toute la nuit.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés longtemps dans le fixateur, à condition qu'il n'évapore pas ni ne s'assèche, car cela pourrait déformer la monocouche.
2. Avant la coloration et après la fixation, éliminez le formaldéhyde et retirez les bouchons semi-solides d'agarose ou de CMC à l'aide d'eau courante ou manuellement avec une spatule. Rincez les plaques d'Avicel à l'eau pour éliminer les résidus de couche de recouvrement ou de fixateur avant la coloration.
3. Pour la coloration, recouvrez les cellules d'une quantité minimale de solution de violet de crésyl pendant environ 15 minutes. Agitez délicatement les plaques si nécessaire afin d'assurer une couverture uniforme.
4. Éliminez délicatement la coloration au violet de crésyl à l'eau. Une fois fixées, colorées et séchées, conservez les plaques indéfiniment pour des analyses ultérieures.

Tableau 1. Conditions d'inoculation et types cellulaires pour le dosage des plaques

	RVFV	VEEV	Grippe B
Type de cellule	Vero	Vero	MDCK
Période d'infection	1 hr	1 hr	45 min
Durée d'incubation	3 days	2 days	3 days

 

Tableau 2. Milieux de croissance virale et cellulaire et milieux pour plaques

	RVFV	VEEV	Grippe B
Type de cellule	Vero	Vero	MDCK
Type de milieu de culture	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Milieu de formation des plaques	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. Milieu Eagle modifié de Dulbecco complété avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine.

2. Milieu d'Eagle modifié de Dulbecco complété avec 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine, 0,2 % d'albumine de sérum bovin, 0,025 % de HEPES, et du DEAE-dextran à 50 µg/ml.

A. Milieu Essentiel Minimum 2x (500 ml) supplémenté avec 5 % de SFB (25 ml), 1 % d'acides aminés minimum essentiels (5 ml), 1 % de pyruvate de sodium (5 ml), 1 % de L-glutamine (5 ml), 2 % de pénicilline/streptomycine (10 ml).

B. Milieu minimal essentiel 2x (500 ml) supplémenté avec 0,2 % d'albumine de sérum bovin, 1 % d'acides aminés essentiels minimaux (5 ml), 50 µg/ml, 0,025 % de HEPES, du DEAE-dextran, de la trypsine-TPCK*

*Juste avant la préparation, ajoutez 1 µl par 25 ml de la solution mère de TPCK-trypsine à 2 µg/ml à l'aliquote que vous utiliserez pour mélanger avec l'agarose afin de former les plaques.

Tableau 3. Stocks de milieux de recouvrement

	RVFV	VEEV	Grippe B
Type de cellule	Vero	Vero	MDCK
Période d'infection	1 hr	1 hr	45 min
Durée d'incubation	3 days	2 days	3 days

 

Tableau 4. Formats des plaques

	6 puits	12 puits	96 puits
Nombre de cellules/puits	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
Volume d'inoculum (μl)	400	200	50
Volume de la couche de recouvrement (ml)	3	1.5	0.100

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Violet de crésyl	Sigma Aldrich	C3886-25G
Solution de formaldéhyde	Sigma Aldrich	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Agiter vigoureusement lors de la reconstitution pour >30 min pour homogénéiser
UltraPure agarose	Invitrogen	16500-100
Carboxyméthylcellulose, sel sodique, viscosité moyenne	Sigma Aldrich	C4888