Le développement précoce de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est caractérisée par un certain nombre de changements de forme cellulaire qui sont bien adaptés pour des approches d'imagerie. Cet article décrit les outils et méthodes de base nécessaires à l'imagerie confocale direct d'embryons de drosophile, et mettra l'accent sur un changement de forme de la cellule appelée cellularisation.
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Article de méthode
Changement de forme d'imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le développement de l'embryon de Drosophila melanogaster subit un certain nombre de changements de forme cellulaire qui sont extrêmement sensibles à vivre l'imagerie confocale. Les changements de forme cellulaire chez la mouche sont analogues à celles dans les organismes supérieurs, et ils conduisent la morphogenèse des tissus. Ainsi, dans de nombreux cas, leur étude a des implications directes pour la compréhension de la maladie humaine (tableau 1) 1-5. Sur l'échelle sub-cellulaire, ces changements de forme des cellules sont le produit d'activités allant de l'expression génique au transduction du signal, la polarité cellulaire, le remodelage du cytosquelette et le trafic membranaire. Ainsi, l'embryon de drosophile permet non seulement le contexte pour évaluer les changements de forme cellulaire comme ils se rapportent à la morphogenèse des tissus, mais offre également un environnement complètement physiologique pour étudier les activités sub-cellulaire que les cellules forme.
Le protocole décrit ici est conçu à l'image d'un changement de cellule spécifique forme appelée cellularisation. Cellularisation est un processus de croissance de la membrane plasmique dramatique, et il convertit finalement l'embryon syncytial dans le blastoderme cellulaire. C'est, à l'interphase du cycle mitotique 14, la membrane plasmique s'invagine simultanément autour de chacun des noyaux ~ 6000 corticale ancré à générer une feuille de cellules épithéliales primaires. Contre les suggestions précédentes, cellularisation n'est pas entraîné par la myosine-2 de la contractilité 6, mais est plutôt largement alimentée par exocytose de la membrane des magasins internes 7. Ainsi, cellularisation est un excellent système pour étudier le trafic membranaire pendant les changements de forme des cellules qui nécessitent une invagination membrane plasmique ou d'expansion, comme la cytocinèse ou transversale-tubules (T-tubules) morphogenèse dans le muscle.
Notez que ce protocole est facilement appliquée à l'imagerie d'autres changements de forme cellulaire dans l'embryon de mouche, et ne nécessite que de légères adaptations telles que changer la scène de la collecte d'embryons, ou en utilisant "colle embryon" pour monter l'embryon dans une orientation spécifique (tableau 1) 8-19. Dans tous les cas, le workflow est fondamentalement le même (figure 1). Les méthodes standard pour le clonage et la transgénèse chez la drosophile sont utilisées pour préparer les stocks de mouche des étables qui expriment une protéine d'intérêt, fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variantes, et ces mouches de fournir une source renouvelable d'embryons. Alternativement, les protéines fluorescentes / sondes sont directement introduits dans des embryons volée via simples techniques de la micro-injection 9-10. Ensuite, selon l'événement de développement et de changer de forme cellulaire à imager, les embryons sont collectés et mis en scène par la morphologie d'un microscope à dissection, et enfin positionné et monté pour imagerie time-lapse sur un microscope confocal.
Protocole
1. Assemblez Coupes de collecte d'embryons
- Découpez le fond d'un 100 mL de Tri-maïs bécher avec un rasoir, ce qui rend le bord aussi lisse que possible. Les tasses sont faciles à manipuler si vous aussi vous taillez les trois coins hors du top, même si cela n'est pas absolument nécessaire.
- Couper un carré de grillage (6 cm x 6 cm). Sur une plaque pré-chauffée à chaud, à l'intérieur d'une hotte, une couche de fumée au carré de grillage sur le dessus d'un morceau de papier d'aluminium épais. Poussez le bord inférieur de la coupe du coupé fermement sur le maillage chaud. Attendez quelques secondes, et soulever la coupe avec la maille maintenant atta....
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Discussion
Le protocole décrit aux présentes permettra de vivre, l'imagerie confocale d'un certain nombre de changements de forme cellulaire dans l'embryon de mouche en développement. Stocks GFP pour l'imagerie peut être préparé par un laboratoire individuel (tableau 2), mais beaucoup de ces stocks sont également accessibles au public à partir des centres tels que la drosophile Bloomington Stock Center à l'Université d'Indiana ( http://flystocks.bio.indian.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous remercions chaleureusement Eric Wieschaus, qui a fourni la base sur laquelle ce protocole a été développé. Notre travail est soutenu par un ministère Verna & Marrs McLean, de Biochimie et Biologie Moléculaire Start-up Award, Baylor College of Medicine.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lames | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Lames couvre-objets 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| Flacons pulvérisateurs (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| Tubes Falcon de 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Embouts pour pipettes, 1 mL | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Flacons de scintillation avec bouchons | VWR international | 66021-533 | |
| Béchers Tri-Corn, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | |
| Plaques de Petri BD Falcon 60x15 mm | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| Filtre cellulaire BD Falcon | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Pointes de pipette jaunes | Rainin | L200 | |
| Maille en acier inoxydable, 304, 12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| Pipettes Pasteur en verre de 5¾ pouces | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Papier filtre P4 | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| Élastiques | Office Max | A620645 | |
| Scotch double face, ½ pouce | Office Max | A8137DM-2 | |
| Brosses à peinture Robert Simmons Expression E85 ronde n°2 | Jerry’s Artarama | 56460 | |
| Pinces Dumont n°5, haute précision en inox | Electron Microscopy Sciences | 72701-DZ | |
| Lames de rasoir | VWR international | 55411-050 | |
| Huile de halocarbone 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| Héptane | Fisher Scientific | H360-1 | |
| Agar BD Bacto | VWR international | 90000-760 | |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Acide p-hydroxybenzoïque | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Levure sèche active Red Star | LeSaffre | 15700 | |
| Serviettes en papier, pliées en C | Kleenex | ||
| Papier d’aluminium extra fort | Reynolds Wrap | ||
| Eau de Javel | Austin’s A-1 Commercial | ||
| Jus de pomme 100 % | Ocean Spray ou Tree Top |
Références
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., G....
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Réimpressions et autorisations
